miR-346及L1細(xì)胞黏附因子在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

朱恩宇, 鄭斯卓, 高 凱※, 石 剛，張 睿

(1.遼寧省中醫(yī)藥研究院 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院外科,沈陽 110034； 2.遼寧省監(jiān)獄管理局總醫(yī)院內(nèi)科,沈陽 110045； 3.中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院 遼寧省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科，沈陽 110042)

近年來，結(jié)腸癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)并趨于年輕化，但在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中，隨著治療觀念的改變及靶向治療的發(fā)展，晚期結(jié)腸癌的治愈率及生存率均獲得明顯提高[1]。對(duì)結(jié)腸癌分子生物學(xué)機(jī)制研究的目的在于對(duì)結(jié)腸癌進(jìn)行早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、預(yù)后分析及探索治療靶點(diǎn)。L1細(xì)胞黏附因子(L1 cell adhesion molecule,L1CAM)在子宮內(nèi)膜癌、食管癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移、浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等具有調(diào)控作用[2-4]。微RNA(microRNA,miRNA)是一類長18～22 nt單鏈非編碼RNA，可特異性識(shí)別并與靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3′非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)結(jié)合，調(diào)控靶mRNA降解，阻礙翻譯過程，調(diào)控惡性腫瘤的生物學(xué)功能[5]。本研究對(duì)miR-346及L1CAM在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其與臨床病理特征的關(guān)系及兩者的相關(guān)性，目的在于探討其在結(jié)腸癌中的生物學(xué)行為及對(duì)結(jié)腸癌預(yù)后的評(píng)估作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 選取2016年5月至2017年5月于中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理標(biāo)本庫保存的手術(shù)切除結(jié)腸癌手術(shù)標(biāo)本68例，包括結(jié)腸癌組、癌旁組織及正常結(jié)腸組織。BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天科技有限公司，L1CAM多克隆抗體購自美國Sigma公司。實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，miRNA提取分離試劑盒、All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒購自美國Abcom公司。引物由大連寶生生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成。

1.2免疫組織化學(xué) 組織標(biāo)本置于10%甲醛中固定24 h，脫水后石蠟包埋，4 μm切片，烘干、脫水、脫蠟、抗原修復(fù)。在3% H2O2每片50 mL及37 ℃烤箱25 min，采用磷酸緩沖鹽溶液洗3次，每次5 min。加入1∶500一抗后濕盒4 ℃孵育過夜。在室溫條件下復(fù)溫20 min，磷酸緩沖鹽溶液洗3次，每次5 min，加二抗37 ℃孵育30 min后二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染5～10 min。自來水洗凈后鹽酸酒精分化10～20 s，流水沖洗30 min。脫水后透明。二甲苯干燥、中性樹膠封片。

1.3實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 取結(jié)腸癌組織標(biāo)本，按RNA分離試劑盒以及Trizol試劑盒操作說明書提取及純化總RNA，將RNA樣本稀釋至濃度為1 g/L，采用紫外吸收法檢測(cè)RNA濃度及純度。應(yīng)用變性瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定RNA完整性。合成樣品互補(bǔ)DNA，進(jìn)行梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品的管家基因(β-actin)實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)，繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線DNA模板，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行待測(cè)基因的檢測(cè)，反應(yīng)體系如下：SYBR Green 1染料10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,脫氧腺苷三磷酸 1 μL,Taq聚合酶2 μL,待測(cè)樣品互補(bǔ)DNA 5 μL,雙蒸餾水30 μL,總體積50 μL。將配制好的聚合酶鏈反應(yīng)溶液置于實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)儀上進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件：93 ℃預(yù)變性2 min，之后94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，73 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后73 ℃ 7 min延伸。采用ΔΔCt法分析溶解曲線。以miR-346/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)吸光度比值進(jìn)行分析。

1.4結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 采用陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度與染色陽性細(xì)胞百分比綜合結(jié)果進(jìn)行判斷結(jié)果[6]。根據(jù)陽性細(xì)胞占一個(gè)400倍視野中所有細(xì)胞總數(shù)的百分比：陽性細(xì)胞數(shù)≤10%計(jì)1分；陽性細(xì)胞數(shù)>10%～50%計(jì)2分；>50%～70%計(jì)3分；>70%計(jì)4分。顯色程度依據(jù)陽性強(qiáng)度進(jìn)行判斷：無染色計(jì)0分；淺染棕黃色計(jì)1分；較深棕黃色計(jì)2分；深棕黃色并且有濃染顆粒計(jì)3分。兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)之和可定為4個(gè)級(jí)別：1分計(jì)陰性(-)；2～3分計(jì)弱陽性(+)；4～5分計(jì)中度陽性(++)；6～7分計(jì)強(qiáng)陽性(+++)。最終結(jié)果以3～7分計(jì)為陽性染色。評(píng)分由三名具有主任醫(yī)師資格的高年資病理科醫(yī)師采用盲法完成。腫瘤根據(jù)最后結(jié)果分為兩組：低表達(dá)組包括陰性(-)和陽性(+)；高表達(dá)組包括中度陽性(++)和強(qiáng)陽性(+++)。

2 結(jié) 果

2.1miR-346、L1CAM mRNA及L1CAM蛋白在組織中的表達(dá) 結(jié)腸癌組織miR-346表達(dá)高于癌旁組織及正常結(jié)腸組織(1.272±0.501比0.621±0.168、0.201±0.078)(F=6.524,P<0.001)，癌旁組織與正常結(jié)腸組織比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.905)。結(jié)腸癌組織L1CAM mRNA表達(dá)高于癌旁組織及正常結(jié)腸組織(1.035±0.592比0.452±0.122、0.246±0.085)(F=5.183,P<0.001),癌旁組織與正常結(jié)腸組織比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.745)。L1CAM蛋白表達(dá)于結(jié)腸癌細(xì)胞膜(圖1a)，在癌旁組織(圖1b)及正常結(jié)腸組織(圖1c)中無表達(dá)，結(jié)腸癌組織中L1CAM蛋白陽性表達(dá)率為74.6%(47/68)。結(jié)腸癌組織中miR-346與L1CAM mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.731，P<0.001)，見圖2。

2.2不同臨床病理特征結(jié)腸癌患者癌組織中miR-346及L1CAM蛋白表達(dá)的比較 不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、病理分型、病理類型患者結(jié)腸癌組織中miR-346及L1CAM蛋白的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在腫瘤浸潤T3～T4、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M1、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、血管浸潤陽性、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期及腫瘤分化程度低分化中表達(dá)更高(均P<0.05),見表1。

1a:L1CAM蛋白在結(jié)腸癌組織高表達(dá)；1b:L1CAM蛋白在正常結(jié)腸組織無表達(dá)；1c:L1CAM蛋白在癌旁組織無表達(dá)

圖2 L1CAM mRNA與miR-346的相關(guān)性

3 討 論

目前結(jié)腸癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì),早期病情隱匿,難以診斷[7-9]。近年來，隨著對(duì)Ⅳ期結(jié)腸癌治療方案的改進(jìn)及靶向藥物的研發(fā)，晚期結(jié)腸癌治愈率及生存率均得到一定程度的提高，對(duì)靶向藥物的探索是結(jié)腸癌生存率進(jìn)一步提高的主要研究方向。隨著分子生物學(xué)及基因檢測(cè)的發(fā)展，為結(jié)腸癌的診斷及治療提供了更多的腫瘤標(biāo)志物、預(yù)測(cè)靶點(diǎn)及治療靶點(diǎn)[10-12]。L1CAM是跨膜糖蛋白的一種，是免疫球蛋白超家族L1家族中的一員。L1家族成員有L1CAM(CD171)、神經(jīng)束蛋白、L1CAM相近同系物等[13]。研究顯示,L1CAM參與多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展，調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及化療耐藥等過程，對(duì)惡性腫瘤的預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值[14]。miRNA作為非編碼RNA，通過特異性識(shí)別并結(jié)合靶mRNA 的3′-UTR參與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控。

表1 不同臨床病理特征結(jié)腸癌患者癌組織中miR-346及L1CAM蛋白表達(dá)的比較

L1CAM：L1細(xì)胞黏附因子；a為F值，余為t值

本研究結(jié)果顯示,miR-346在結(jié)腸癌組織中表達(dá)高于癌旁組織及正常結(jié)腸組織。L1CAM mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織及正常結(jié)腸組織L1CAM蛋白表達(dá)于結(jié)腸癌細(xì)胞膜，在癌旁組織及正常結(jié)腸組織中無表達(dá)。結(jié)腸癌組織中L1CAM蛋白陽性表達(dá)率為74.6%。結(jié)腸癌組織中miR-346與L1CAM mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)。這表明，miR-346可能通過調(diào)控L1CAM表達(dá)介導(dǎo)結(jié)腸癌惡性行為。另有研究顯示，L1CAM在子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、食管癌及胰腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)水平高于相應(yīng)正常組織，提示腫瘤的預(yù)后不良[2-5]。本研究進(jìn)一步顯示，結(jié)腸癌組織中miR-346及L1CAM蛋白高表達(dá)者腫瘤浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤、TNM分期及腫瘤分化程度均較差,腫瘤浸潤深度T3及T4、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤、TNM分期差及腫瘤分化程度差的結(jié)腸癌組織中miR-346及L1CAM表達(dá)量高。這表明，在結(jié)腸癌中，miR-346及L1CAM高表達(dá)時(shí)，腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移惡性行為能力增強(qiáng)，可能對(duì)腫瘤惡性行為具有促進(jìn)作用。miRNA通過靶基因?qū)Y(jié)直腸癌唾液酸化的調(diào)控作用，可能在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移等惡性行為調(diào)控及化療耐藥方面具有重要作用。在中華地鼠卵巢細(xì)胞中，L1CAM通過磷脂酰肌醇-3-激酶及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路調(diào)控糖化過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移過程[14]。Ito等[15]通過小干擾RNA敲除胃癌細(xì)胞中L1CAM表達(dá)，在胃癌細(xì)胞株中，L1CAM是通過胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的惡性行為。Schirmer等[16]研究顯示，在子宮內(nèi)膜癌HEC1B細(xì)胞中，miR-34a過表達(dá)下調(diào)L1CAM表達(dá)，抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移。p53激活會(huì)導(dǎo)致miR-34a上調(diào)，L1CAM表達(dá)下調(diào),因此miR-34a對(duì)L1CAM具有調(diào)控作用。miR-34a可以結(jié)合到L1CAM mRNA的3′UTR端，L1CAM在轉(zhuǎn)錄水平受到miRNA調(diào)控[17]。通過TGGA數(shù)據(jù)挖掘、生物信息學(xué)檢索及文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，miR-346在惡性腫瘤中的研究較少，miR-346通過抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制因子1表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展[18]。有研究顯示，在肝細(xì)胞癌中miR-346通過SET和MYND域包含蛋白3依賴性通路抑制細(xì)胞增殖[19]。miR-346通過靶向作用于Krüppel樣因子4調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及分化[20]。

結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及化療耐藥等的機(jī)制研究，目前以信號(hào)通路的研究及上下游調(diào)控基因的發(fā)掘?yàn)橹饕较?，靶向治療及免疫治療為腫瘤耐藥提供了新的有效治療方案，針對(duì)不同靶點(diǎn)的靶向藥物綜合治療可能是進(jìn)一步提高晚期結(jié)直腸癌生存期的策略。因此，更多治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)是進(jìn)一步擴(kuò)大靶向治療范圍的主要手段，本研究首先通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)miR-346與L1CAM可能具有相關(guān)性，L1CAM及miR-346在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào),可能對(duì)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移及侵襲等惡性行為具有調(diào)控作用,兩者可能具有靶向調(diào)控關(guān)系，成為結(jié)腸癌的腫瘤標(biāo)志物或預(yù)測(cè)因子，兩者可能具有上下游的調(diào)控關(guān)系，但兩者的上下游關(guān)系和作用機(jī)制及是否可以成為靶向治療的治療靶點(diǎn)需進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)論證。