鐵皮石斛不同花期及花朵不同部位活性組分分析

辛小雪，王雪香，李明宇，郭紅艷，王曉潔，蘇 鈦，徐 萍，程 瑾

（1.北京林業(yè)大學 生物科學與技術(shù)學院 花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室，北京 100083；2.國家林業(yè)和草原局 野生動植物保護與自然保護區(qū)管理司，北京100714；3.云南省藥物研究所，云南昆明 650111；4.北京延慶區(qū)果品服務中心，北京 102100）

石斛屬Dendrobium為蘭科Orchidaceae多年生草本附生植物，全世界有1 500～2 000種，廣泛分布于亞洲熱帶、亞熱帶地區(qū)以及大洋洲［1-2］。在中國，石斛屬植物主要分布于華南、西南和華東地區(qū)，常用的藥用栽培石斛有30余種［3-4］。其中鐵皮石斛Dendrobium officinale作為藥用價值較高的一種，因具有益胃生津、滋陰清熱的功效，其新鮮或干燥莖被單列收載于2015版《中華人民共和國藥典》中，以區(qū)別于其他藥用石斛［5］?，F(xiàn)代研究表明，鐵皮石斛在提高免疫力，抗腫瘤，降血糖血壓，抗疲勞，促消化，抗肝損傷等方面有顯著功效［6-8］。近年來，鐵皮石斛的人工繁育和培植技術(shù)取得了一系列的進展［9-10］，并在云南、浙江、安徽、福建、廣西、貴州等地開展了規(guī)范化人工大棚栽培和生態(tài)化的仿野生種植，其栽培品已成為與野生鐵皮石斛藥用成分指標相近的絕佳替代品。鐵皮石斛常以莖入藥，其主要功能成分為多糖、黃酮類、酚類、聯(lián)芐類、菲類、氨基酸、礦質(zhì)元素等［11-14］。其中多糖是鐵皮石斛重要的功能活性物質(zhì)，酚類和黃酮類化合物含量也被認為與自由基清除能力有顯著相關性，具有抗氧化，抗腫瘤的藥理活性［15-17］。隨著鐵皮石斛多樣性產(chǎn)品的開發(fā)，鐵皮石斛花因具有與莖相似的多糖、黃酮類、有機酸類和萜類等資源性成分和功效而逐漸被關注［18-20］。但相關研究多限于花中單一活性成分的提取或水提物的功能鑒定，對花中主要化學成分的積累及分布研究相對較少，使鐵皮石斛花產(chǎn)品停留在初加工水平，造成了資源浪費。本研究通過對鐵皮石斛花苞期、微開期及盛花期3個不同花期及盛花期花被、合蕊柱和子房3個不同花部位的多糖、總黃酮、總酚質(zhì)量分數(shù)的研究，旨在探討鐵皮石斛花的活性成分組成，確定鐵皮石斛花的最佳采收期及最佳采收部位，進一步優(yōu)化鐵皮石斛花產(chǎn)品的精加工工藝。

1 材料與方法

1.1 植物材料

鐵皮石斛花樣品采自廣西樂業(yè)縣雅長蘭科植物國家級自然保護區(qū)鐵皮石斛種植基地，分別采集處于花苞期、微開期、盛花期的鐵皮石斛花鮮品，以及盛花期鐵皮石斛花花被、合蕊柱和子房3個部位的鮮品。所有鮮品均于80℃干燥箱中干燥4 h后得干燥樣品，鐵皮石斛不同花期及盛花期不同花部位的干燥樣品經(jīng)粉碎后過60目篩，得各處理待測樣品。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 實驗試劑 D-無水葡萄糖（上海源葉生物科技有限公司）；蘆丁（北京索萊寶科技有限公司）；沒食子酸、硝酸鋁（國藥集團化學試劑有限公司）；無水乙醇、亞硝酸鈉、碳酸鈉、濃硫酸（北京化工廠）；氫氧化鈉（西隴科學股份有限公司）；苯酚［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］。其中D-無水葡萄糖、蘆丁為色譜純，其余為分析純。

1.2.2 實驗儀器 電子分析天平ML 104（梅特勒-托利多儀器有限公司）；恒溫水浴鍋DZKW-D-2（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；紫外可見分光光度計Bio Mate 3S［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；真空泵GM-0.33A（天津市津騰實驗設備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀IKA RV10（艾卡儀器設備有限公司）；恒溫循環(huán)器HX-1050［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；超聲波清洗器KQ 5200E（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

采用2015版《中華人民共和國藥典》［5］中水溶醇沉法提取花中多糖成分，苯酚-硫酸法測定多糖質(zhì)量分數(shù)。參照唐靜月等［21］總黃酮測定方法，以體積分數(shù)為80%乙醇超聲波法提取花中總黃酮成分，亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測定總黃酮質(zhì)量分數(shù)。參考GB/T 31740.2-2015《茶制品第2部分：茶多酚》，以體積分數(shù)為80%乙醇超聲波法提取花中總酚成分，采用福林酚法測定其總酚質(zhì)量分數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

鐵皮石斛花不同花期及盛花期不同部位的多糖、總黃酮、總酚的質(zhì)量分數(shù)用均值±標準差表示，并運用SPSS 17.0進行單因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛花不同花期及盛花期不同部位花形態(tài)特征

鐵皮石斛花苞期花為綠色，花瓣完全包裹在內(nèi)（圖1A）；微開期花瓣微張，向內(nèi)傾斜（圖1B）；盛花期花完全張開，花為黃色，花各部位清晰可見（圖1C）。鐵皮石斛盛花期各部位解剖如圖1D所示，其雌蕊和雄蕊合生特化成合蕊柱，為蘭科植物所特有的結(jié)構(gòu)；花萼、花瓣及唇瓣統(tǒng)稱為花被。

圖1 鐵皮石斛鮮花不同花期及盛花期花解剖結(jié)構(gòu)Figure 1 Dendrobium officinale flower at different flowering stages and anatomic structures at flourishing flowering stage

2.2 鐵皮石斛花不同花期及盛花期不同部位多糖質(zhì)量分數(shù)變化

如表1和表2所示：從花苞期到微開期再到完全開放的盛花期過程中，鐵皮石斛花中多糖成分逐漸積累，其中盛花期多糖質(zhì)量分數(shù)為61.5 mg·g－1，顯著高于花苞期和微開期；微開期為55.3 mg·g－1，花苞期為45.6 mg·g－1，二者無顯著差異。盛花期花不同部位多糖質(zhì)量分數(shù)的測定結(jié)果顯示：花被中多糖質(zhì)量分數(shù)最高，為64.5 mg·g－1，合蕊柱次之為61.2 mg·g－1，二者無顯著差異。子房與花被、合蕊柱的多糖質(zhì)量分數(shù)具有顯著差異（P＜0.05），僅為52.3 mg·g－1。結(jié)果表明鐵皮石斛花不同花期多糖質(zhì)量分數(shù)為盛花期＞微開期＞花苞期；盛花期花不同部位多糖質(zhì)量分數(shù)為花被＞合蕊柱＞子房。

2.3 鐵皮石斛花不同花期及盛花期不同部位總黃酮質(zhì)量分數(shù)變化

如表1和表2所示：鐵皮石斛不同花期總黃酮質(zhì)量分數(shù)在花苞期最高，為19.9 mg·g－1，盛花期為19.2 mg·g－1， 二者無顯著差異； 微開期最低， 為 17.4 mg·g－1， 與花苞期和盛花期存在顯著差異（P＜0.05）。 盛花期鐵皮石斛花被中總黃酮質(zhì)量分數(shù)最高（24.2 mg·g－1）， 其次是合蕊柱， 為 14.3 mg·g－1， 子房最低，為11.4 mg·g－1。因此鐵皮石斛花不同花期總黃酮質(zhì)量分數(shù)為花苞期＞盛花期＞微開期。盛花期花不同部位總黃酮質(zhì)量分數(shù)為花被＞合蕊柱＞子房，三者差異顯著。

2.4 鐵皮石斛花不同花期及盛花期不同部位總酚質(zhì)量分數(shù)變化

鐵皮石斛花中酚類物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)隨花的逐漸開放而積累，盛花期花中總酚質(zhì)量分數(shù)達到最大值為22.2 mg·g－1，顯著高于微開期和花苞期；微開期為 19.6 mg·g－1， 花苞期最低， 為 18.5 mg·g－1（表 1）。盛花期鐵皮石斛花不同部位總酚質(zhì)量分數(shù)存在顯著差異（P＜0.05），其中花被最高，為26.5 mg·g－1，合蕊柱次之，子房最低，總酚質(zhì)量分數(shù)分別是19.2和13.9 mg·g－1（表2）。結(jié)果表明鐵皮石斛花不同花期總酚質(zhì)量分數(shù)為盛花期＞微開期＞花苞期；盛花期花不同部位總酚質(zhì)量分數(shù)為花被＞合蕊柱＞子房。

表1 不同花期鐵皮石斛全花多糖、總黃酮及總酚質(zhì)量分數(shù)Table 1 Contents of polysaccharides,total flavonoids and total phenols in entire flower of Dendrobium officinale at different flowering stages

表2 盛花期鐵皮石斛花不同部位多糖、總黃酮及總酚質(zhì)量分數(shù)Table 2 Contents of polysaccharides,total flavonoids and total phenols in different parts of D.officinale flower at flourishing flowering stage

3 討論

鐵皮石斛花中多糖隨花的開放而逐漸積累，表現(xiàn)在盛花期花多糖質(zhì)量分數(shù)顯著高于微開期，高于花苞期，這種規(guī)律性與黃秀紅等［22］的研究結(jié)果相同。鐵皮石斛花不同部位均含有一定的多糖成分，其中花被中多糖質(zhì)量分數(shù)最高。鐵皮石斛花中多糖質(zhì)量分數(shù)雖與莖中差異較大［19,23］，但花中多糖的單糖組成與莖相似，且花中多糖有非常強的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力［20,24］。

鐵皮石斛莖、葉、花中均含有大量黃酮類化合物，并具有清除自由基、抗氧化和降血糖等藥理活性，其中花中黃酮類化合物質(zhì)量分數(shù)及抗氧化能力顯著高于莖［18,23,25-27］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛花苞期及盛花期花中總黃酮質(zhì)量分數(shù)較高，并高于黃秀紅等［22］的測定結(jié)果，但低于龔慶芳等［23］的測定結(jié)果，這可能與品種及提取方法不同有關。鐵皮石斛各花期總黃酮質(zhì)量分數(shù)均顯著高于其他石斛花中總黃酮質(zhì)量分數(shù)，如球花石斛Dendrobium thyrsiflorum，鼓槌石斛D.chrysotoxum［22,28］。因此若以黃酮類物質(zhì)作為藥用產(chǎn)品開發(fā)，可優(yōu)先選擇鐵皮石斛花作為提取材料，以花苞期或盛花期作為最佳采收期。

酚類是植物中的天然抗氧化劑，也是鐵皮石斛的藥用活性成分之一，具有較強的清除自由基和抗衰老的功效［23,29-30］。鐵皮石斛花中總酚質(zhì)量分數(shù)隨花的開放而逐漸積累，盛花期最高，花被是酚類物質(zhì)的主要積累部位。有研究發(fā)現(xiàn)：鐵皮石斛花中總酚質(zhì)量分數(shù)與莖中相近，抗氧化作用也無較大差異［23］，因此若以總酚作為鐵皮石斛的目標產(chǎn)物，花材料可作為莖的補充材料加以利用，盛花期為花的最佳采收期，花被為精加工產(chǎn)品的最佳采收部位。此外鐵皮石斛花中總酚與總黃酮質(zhì)量分數(shù)較高且相近，使得鐵皮石斛花具有很強的抗氧化活性，這可能也是鐵皮石斛花具有 “滋陰”功效的原因之一［31］，但花中酚類與黃酮類物質(zhì)的具體活性成分還有待進一步研究。

雅長鐵皮石斛2014年成為國家地理標志保護產(chǎn)品，這是廣西樂業(yè)縣迄今為止唯一獲得國家地理標志產(chǎn)品保護的產(chǎn)品。從節(jié)約生產(chǎn)成本及藥用效益最大化的方面考慮，建議選擇盛花期作為鐵皮石斛花的最佳采收期；盛花期花被作為最佳采收部位。多糖，黃酮類及酚類化合物是鐵皮石斛花中的主要活性組分，其中花中總黃酮及總酚質(zhì)量分數(shù)較高，可作為藥用組分進一步開發(fā)研究。鐵皮石斛花中活性組分含量受品種、生長地和生長周期的影響，鐵皮石斛栽培品種多，栽植范圍廣，有關鐵皮石斛種源和栽培方法與其活性組分積累的關系值得開展深入研究。