毛蕊花苷對(duì)高原缺氧小鼠記憶損傷的改善及機(jī)制研究

朱玉婷，王謹(jǐn)慧，李茂星, ，李曉琳,，陶文迪，劉延彤

(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州總醫(yī)院全軍高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730050；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 7350000；4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

隨著越來越多的人進(jìn)入高原地區(qū)生活、工作，高原上的低壓缺氧環(huán)境作為一種損傷和致病因素逐漸凸顯出來。缺氧可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，引起高山病、肺水腫、腦水腫、感覺及運(yùn)動(dòng)功能障礙等一系列急慢性疾病[1-2]，導(dǎo)致記憶損傷，作業(yè)效能下降。

毛蕊花苷(圖1)是一種廣泛分布于蓯蓉、馬先蒿、螃蟹甲等多種雙子葉植物的苯乙醇苷類化合物，又稱類葉升麻苷、麥角甾苷。研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊花苷具有顯著的抗氧化[3]、抗菌抗炎[4-5]、抗病毒[6]、抗腫瘤[7]、增強(qiáng)記憶力[8]等生理活性。課題組前期研究表明，從藏藥馬先蒿中提取得到的苯乙醇苷富含毛蕊花苷，具有明顯的高原缺氧記憶損傷保護(hù)作用[9]。本實(shí)驗(yàn)采用毛蕊花苷干預(yù)高原缺氧時(shí)小鼠八臂迷宮實(shí)驗(yàn)，從氧化應(yīng)激方面探究其對(duì)高原記憶的改善作用，闡明其可能的機(jī)制。

圖1 毛蕊花苷結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性BALB/C小鼠90只，體重(20±2)g，蘭州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(軍)2012-0020，使用許可證號(hào)：SYXK(軍)2012-0029。飼養(yǎng)室溫度為(25±2)℃，每12 h明暗交替，維持飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水。為了保證小鼠能健康生長并順利實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行八臂迷宮訓(xùn)練過程中限制其飲食，使體重維持在自由進(jìn)食的80%～85%。

1.2 藥品與試劑

毛蕊花苷為實(shí)驗(yàn)室自制(HPLC法測定含量，以毛蕊花糖苷計(jì)為81.39%)；總蛋白定量試劑盒(BCA法，批號(hào)：20170726)、活性氧(ROS)測試盒(批號(hào)：20170724)、微量還原型谷胱甘肽(GSH)測試盒(批號(hào)：20170724)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒(批號(hào)：20170724)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào)：20170726)，均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材

RM-200八臂迷宮分析測試系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；DYC-3070 大型低壓氧倉(貴州風(fēng)雷航空軍械有限公司)；BP210S電子天平(賽多利斯有限公司)；全自動(dòng)樣品快速研磨儀JXFSTPRP-24(上海凈信科技)；Sigma 3K15低溫離心機(jī)(德國Sigma公司)。

2 方法

2.1 八臂迷宮訓(xùn)練

八臂迷宮實(shí)驗(yàn)開始前先讓小鼠在迷宮內(nèi)適應(yīng)環(huán)境，2次/d，一次3～4只。適應(yīng)環(huán)境時(shí)在每臂都放置食物，小鼠自由攝取食物180 s。開始訓(xùn)練后，只在迷宮的4個(gè)臂放置食物(1、2、4、6臂)，并貼信號(hào)圖片，維持此順序至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。起初先將小鼠置于迷宮中央?yún)^(qū)的透明艙內(nèi)， 15 s后撤除透明艙，讓小鼠自由覓食，待180 s末或動(dòng)物完成所有放食臂的覓食時(shí)作為一次訓(xùn)練結(jié)束。檢測的指標(biāo)為：①工作記憶錯(cuò)誤(working memory errors，WME)：小鼠在同一次訓(xùn)練中第二次或多次進(jìn)入已經(jīng)吃過食物的臂；②參考記憶錯(cuò)誤(reference memory errors, RME)：小鼠進(jìn)入無食物臂；③錯(cuò)誤總數(shù)(total errors，TE)：180 s內(nèi)的錯(cuò)誤總數(shù)；④潛伏期(total reaction times，TT)：小鼠完成一次訓(xùn)練所用時(shí)間。當(dāng)連續(xù)5次TE≤1，同時(shí)WME=0則可視為訓(xùn)練成功(連續(xù)訓(xùn)練25 d)。

2.2 動(dòng)物分組及給藥方式

從訓(xùn)練成功的小鼠中挑選出50只隨機(jī)分為5組(常氧對(duì)照組，缺氧模型組，毛蕊花苷低、中、高劑量組)，每組10只。自分組起，毛蕊花苷低、中、高劑量組分別給予50、 150、300 mg/kg藥物灌胃，常氧對(duì)照組和缺氧模型組給予等體積的蒸餾水(0.1 ml/10 g)灌胃，連續(xù)7 d，1次/d。

2.3 高原低壓低氧模型的制備

給藥第4 天，用八臂迷宮測試系統(tǒng)測試各組小鼠的WME、RME、TE及TT，每只測試2次，取平均值。測試后，常氧對(duì)照組置于飼養(yǎng)室(海拔約1 500 m)，剩余各組置于大型低壓氧艙中，模擬海拔7 500 m 高原環(huán)境(艙內(nèi)壓力：35.9 kPa，氧分壓：8.0 kPa)，每天上午9點(diǎn)以2 m/s勻速下降至4 000 m(艙內(nèi)壓力：62.1 kPa，氧分壓：13.0 kPa)，實(shí)驗(yàn)員進(jìn)入在艙內(nèi)灌胃給藥并加水補(bǔ)食，連續(xù)3 d。給藥結(jié)束后，將低壓氧艙以2 m/s勻速上升至7 500 m，在氧艙中的小鼠可自由飲水、攝食。

2.4 八臂迷宮實(shí)驗(yàn)測定小鼠空間記憶能力

第7天，對(duì)5組小鼠進(jìn)行八臂迷宮測試(在海拔4 000 m低壓氧艙內(nèi)進(jìn)行)，記錄各組小鼠WME、RME、TE及TT，每只測試2次，取平均值。對(duì)照前后2次測試結(jié)果，考察在高原缺氧環(huán)境下毛蕊花苷對(duì)小鼠記憶損傷的改善作用。

2.5 血漿和腦組織MDA、GSH含量、T-SOD活力、腦組織ROS含量測定

各組小鼠八臂迷宮測試完畢后，眼球取血，脫臼處死。在冰盤上剝?nèi)∧X組織。BCA法測定腦組織勻漿蛋白含量，按試劑盒說明書測定血漿和腦組織的MDA、GSH含量和T-SOD活力，腦組織ROS含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 毛蕊花苷對(duì)高原記憶損傷小鼠八臂迷宮測試結(jié)果的影響

與常氧對(duì)照組比較， 缺氧模型組WME、RME、TE及TT分別增加933%、294%、390%和157%(P<0.01)。與缺氧模型組比較，毛蕊花苷高劑量組WME、RME、TE及TT分別降低58.1%、59.7%、59.2%及46.3%(P<0.01)；毛蕊花苷中劑量組WME、RME、TE及TT分別降低54.8%、56.7%、56.1%及42.5%(P<0.01)；毛蕊花苷低劑量組TT降低27.6%(P<0.05)，見表 1。

表1 毛蕊花苷對(duì)小鼠八臂迷宮測試結(jié)果的影響

**P<0.01，與常氧對(duì)照組比較；#P<0.05，##P<0.01，與缺氧模型組比較

3.2 毛蕊花苷對(duì)小鼠血漿MDA、腦組織MDA和ROS的影響

與常氧對(duì)照組比較， 缺氧模型組小鼠血漿MDA、腦組織MDA和ROS含量分別增加74.8%、122%和92.2%(P<0.01)。與缺氧模型組比較，毛蕊花苷高劑量組小鼠血漿MDA、腦組織MDA和ROS含量分別降低31.7%、34.7%和32.8%(P<0.01)；毛蕊花苷中劑量組小鼠腦組織MDA和ROS含量分別降低30.2%和23.2%(P<0.01)，見表2。

3.3 毛蕊花苷對(duì)小鼠血漿和腦組織GSH含量、T-SOD活力的影響

與常氧對(duì)照組比較，缺氧模型組小鼠血漿和腦組織GSH含量、T-SOD活力分別降低32.4%、36.8%、18.7%和31.6%(P<0.01)。與缺氧模型組比較，毛蕊花苷高劑量組小鼠血漿和腦組織GSH含量、T-SOD活力分別升高39.0%、51.6%、20.5%及37.8%(P<0.05，P<0.01)；毛蕊花苷中劑量組小鼠血漿GSH含量、T-SOD活力和腦組織GSH含量分別升高34.5%、16.4%及48.3%(P<0.05，P<0.01)，見表 3。

表2 毛蕊花苷對(duì)小鼠血漿MDA、腦組織MDA和ROS的影響

**P<0.01，與常氧對(duì)照組比較；#P<0.05，##P<0.01，與缺氧模型組比較

表3 毛蕊花苷對(duì)小鼠血漿和腦組織GSH含量、T-SOD活力的影響

*P<0.05，**P<0.01，與常氧對(duì)照組比較；#P<0.05，##P<0.01，與缺氧模型組比較

4 討論

學(xué)習(xí)記憶的能力直接反映了大腦作為高級(jí)中樞對(duì)其他組織器官信息的整合能力。高原缺氧使得進(jìn)入該環(huán)境的人產(chǎn)生不同程度的腦損傷，導(dǎo)致記憶功能障礙，作業(yè)效能下降。研究發(fā)現(xiàn)，高原低壓低氧暴露能改變?nèi)说乃吣Ｊ?，增加覺醒次數(shù)；使人變得壓抑、焦躁；分散注意力，降低記憶力和執(zhí)行力[10]。

本實(shí)驗(yàn)中，八臂迷宮測試結(jié)果顯示，缺氧模型組小鼠的WME、RME、TE和TT與常氧對(duì)照組相比明顯升高，表明高原缺氧的確造成了動(dòng)物的記憶損傷。給予毛蕊花苷干預(yù)后，各組WME、RME、TE和TT相比于缺氧模型組則有顯著降低，表明毛蕊花苷確實(shí)對(duì)高原缺氧記憶損傷有改善作用。

高原缺氧環(huán)境可激發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，組織中的氧自由基和氮自由基生成增多，進(jìn)一步造成器官損傷。腦組織(特別是大腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體)抗氧化系統(tǒng)非常薄弱，對(duì)氧異常敏感。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)血漿和腦組織MDA、GSH含量、T-SOD活力和腦組織ROS含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明氧化應(yīng)激可能是引起神經(jīng)元損傷的重要因素之一。相比而言，毛蕊花苷干預(yù)后，血漿和腦組織中的ROS、MDA含量顯著降低，GSH含量、T-SOD活力明顯升高，提示毛蕊花苷對(duì)高原缺氧小鼠記憶損傷的改善作用可能是通過穩(wěn)定機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)的平衡，減輕氧化應(yīng)激來實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)驗(yàn)選擇毛蕊花苷低(50 mg/kg)、中(150 mg/kg)、高(300 mg/kg)3個(gè)劑量組灌胃給藥，考察毛蕊花苷對(duì)小鼠高原缺氧記憶損傷改善作用的量-效關(guān)系。結(jié)果顯示，低劑量組八臂迷宮測試和氧化應(yīng)激指標(biāo)大多與缺氧模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是因?yàn)閯┝课催_(dá)到最小有效量。中、高劑量組的各項(xiàng)指標(biāo)顯示毛蕊花苷的確有較好的抗高原缺氧記憶損傷的效果。

綜上所述，毛蕊花苷對(duì)高原缺氧記憶損傷改善作用的機(jī)制之一可能是穩(wěn)定機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)的平衡、減輕氧化應(yīng)激，是否還有其他機(jī)制尚待研究。