強(qiáng)化植物修復(fù)重金屬污染土壤的策略及其機(jī)制

袁金瑋 陳笈 陳芳 劉萬宏

（重慶科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶401331）

隨著全球工業(yè)化程度的高度發(fā)展以及生物地球化學(xué)循環(huán)紊亂加劇，土壤重金屬污染已成為全球最嚴(yán)重的環(huán)境治理難題之一［1］。《全國土壤污染調(diào)查公報(bào)》（2014）數(shù)據(jù)顯示我國土壤污染總超標(biāo)率高達(dá)16.1%，以Cd、Ni和As等8種重金屬為主的無機(jī)污染物超標(biāo)點(diǎn)位數(shù)占全部超標(biāo)點(diǎn)位的82.8%。重金屬污染至少影響了3.6×106hm2農(nóng)作物生長，導(dǎo)致每年將近損失106t農(nóng)作物產(chǎn)品［2］。此外，重金屬污染土壤會持續(xù)給人類造成很高的致癌風(fēng)險(xiǎn)［3］。因此，重金屬污染所帶來的生態(tài)環(huán)境、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、人類健康等諸多方面的問題是目前擺在人類面前亟需解決的科學(xué)與社會難題。

諸如原位熔融固化技術(shù)、土壤淋洗技術(shù)等基于物理或化學(xué)原理的技術(shù)方法已經(jīng)開始應(yīng)用到土壤重金屬污染修復(fù)［4］，然而這些技術(shù)通常具有勞動(dòng)強(qiáng)度大、成本高、造成土壤物化性質(zhì)不可逆改變等缺點(diǎn)，從而在土壤重金屬污染修復(fù)應(yīng)用中存在局限性［5］。植物修復(fù)（Phytoremediation）因其具有經(jīng)濟(jì)有效、綠色生態(tài)及環(huán)境友好等諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為土壤重金屬污染修復(fù)研究領(lǐng)域熱點(diǎn)。近年來關(guān)于重金屬超富集植物的篩選與效能評價(jià)有諸多報(bào)道，通常認(rèn)為理想的重金屬超富集植物應(yīng)具備以下生理特征：（1）具有較高的生長速率及生物量；（2）具有較強(qiáng)的耐受重金屬毒害能力；（3）具有發(fā)達(dá)的地下根系統(tǒng)用以攝取土壤中重金屬；（4）能夠?qū)⒏兄亟饘俎D(zhuǎn)運(yùn)至地上部分便于收集處理［1，5］。在實(shí)踐應(yīng)用中，植物修復(fù)技術(shù)同樣會受到諸多方面的制約，如重金屬毒害作用抑制植物生長發(fā)育、土壤中重金屬生物利用度、有機(jī)結(jié)合重金屬污染物中重金屬游離抑制等［6］。為了解決植物修復(fù)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的局限性，目前主要從“外源”和“內(nèi)源”兩個(gè)方向采取措施強(qiáng)化植物修復(fù)重金屬污染土壤的能力?！巴庠础辈呗灾饕ㄟ^接種微生物構(gòu)建微生物-植物共生體系，促進(jìn)植物的生長或增強(qiáng)植物對重金屬的耐受能力；或在植物修復(fù)過程中外源添加螯合劑，促進(jìn)土壤中重金屬的游離，增強(qiáng)重金屬的生物利用度。而“內(nèi)源”策略主要是基于基因工程手段，表達(dá)與重金屬脅迫響應(yīng)相關(guān)基因，從而增強(qiáng)植物的對重金屬脅迫耐受、重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)等方面的能力。同時(shí)深入研究相應(yīng)的機(jī)制將進(jìn)一步豐富和完善植物修復(fù)的理論體系。

1 微生物強(qiáng)化植物修復(fù)重金屬污染能力

在自然環(huán)境中微生物通常與植物存在互利共生關(guān)系，這類微生物包括在根部共生的根際微生物（Rhizosphere），在植物內(nèi)部共生的內(nèi)生微生物（Endophytes）和在植物地上器官共生的葉際微生物（Phyllosphere）。在微生物-植物共生系統(tǒng)中，環(huán)境微生物通常具有增強(qiáng)植物抗逆性、輔助植物營養(yǎng)吸收、合成及分泌植物激素促進(jìn)植物生長等生物學(xué)功能。此外，大量研究結(jié)果顯示微生物-植物之間的相互作用有助于促進(jìn)植物降解有機(jī)污染物、解除重金屬毒性等重要作用［7］。因此，探索微生物在植物修復(fù)重金屬污染領(lǐng)域的作用對闡明植物修復(fù)機(jī)制以及植物修復(fù)技術(shù)推廣應(yīng)用奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

1.1 根瘤菌（Rhizobiales）

根瘤菌是一類可侵染豆科植物根部形成根瘤，并能夠進(jìn)行固氮作用的革蘭氏陰性菌。眾所周知根瘤菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)根瘤菌能夠有效地強(qiáng)化植物修復(fù)重金屬污染效果［8］。Yu等［9］從尾礦土壤中分離獲得的慢生大豆根瘤菌（Bradyrhizobium Liaoningense）具有較強(qiáng)的金屬耐受性，并發(fā)現(xiàn)慢生大豆根瘤菌與豆科植物水黃皮（Pongamia pinnata）共生能夠促進(jìn)宿主在釩鈦磁鐵礦尾礦土壤和含Ni土壤中生長，并極大地提高了Fe和Ni等金屬離子的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)。將根瘤菌Cupriavidus taiwanensis接種至含羞草（Mimosa pudica）形成根瘤后發(fā)現(xiàn)宿主植株吸收Pb、Cu和Cd的能力顯著增加，其中對Pb的吸收能力最強(qiáng)，這與根瘤菌對Pb耐受能力最強(qiáng)的結(jié)果相一致，暗示微生物能夠影響宿主植物吸收重金屬種類的偏好性［10］。

1.2 叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）

AMF是能夠定殖于植物宿主根部并與宿主形成互利共生關(guān)系的一類真菌。土壤環(huán)境中的磷酸鹽、微量元素和水能夠被AMF吸收作為營養(yǎng)物質(zhì)，此外也發(fā)現(xiàn)重金屬能被AMF菌絲吸收并轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主［11］。AMF具有一定的宿主選擇性，其并不能與十字花科、燈心草科等超富集植物共生發(fā)育形成叢枝菌根，但能夠定殖于部分豆科、菊科及蕨類植物根部［12］。Yang等［13］發(fā)現(xiàn)AMF不僅能夠提高栽培在不同濃度Pb土壤中豆科植物刺槐（Robinia pseudoacacia）生物量的增加，同時(shí)刺槐根部Pb濃度較未定殖AMF的植株具有顯著提高。與AMF共生的蕨類植物蜈蚣草（Pteris vittata）在As污染土壤中生長具有更高的生物量，接種了AMF的蜈蚣草植株中As含量較對照提高了1.45倍［14］。不同種類的AMF對同一宿主植物攝取重金屬能力影響是不盡相同的，接種了Glomus intraradices的宿主比未接種的植物攝取As和Zn的能力分別提高了14倍和7倍，而接種了Gigaspora gigantea的宿主僅比對照分別提高了2.5和1.9倍［15］，這些結(jié)果均表明AMF能夠有效地強(qiáng)化植物修復(fù)，具有良好的應(yīng)用前景。

1.3 溶磷微生物（Phosphate solubilizing microbes，PSM）

PSM指功能上能夠?qū)⑼寥乐胁豢扇軤顟B(tài)的磷轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄誀顟B(tài)的磷供給植物利用，分類學(xué)上通常屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等一類微生物的總稱。PSM在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛作為生物菌肥促進(jìn)農(nóng)作物生長及增加產(chǎn)量，從而避免過度使用化學(xué)磷肥導(dǎo)致土壤退化的問題［16］。近年來研究發(fā)現(xiàn)PSM能夠促進(jìn)植物在重金屬污染土壤中生長、解除重金屬毒性、增強(qiáng)植物吸收重金屬的效率等特性。從重金屬污染水體中分離到的假單胞菌屬菌株OSG41具有很強(qiáng)的Cr耐受能力，鷹嘴豆（Cicerarietinum）接種OSG41后對Cr具有較強(qiáng)耐受性，植物干重、產(chǎn)量和蛋白總量較對照均有提高，表明OSG41對鷹嘴豆具有解除Cr毒性和促進(jìn)生長的作用［17］。Li等［18］發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬菌株TLC 6-6.5-4能夠有效降低Cu對玉米和向日葵的毒性，并促進(jìn)了植物對Cu的吸收，植物體內(nèi)Cu濃度較對照分別提高2.8倍和1.7倍。巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）能夠促進(jìn)芥菜（Brassica juncea）和苘麻（Abutilon theophrasti）中Cd的濃度積累，分別達(dá)到1.6和1.8 mg/g，較對照提高了2倍以上［19］。利用PSM不僅能改善土壤退化的問題，在重金屬污染土壤中接種PSM還能夠有效地提高宿主植物修復(fù)能力。

1.4 內(nèi)生細(xì)菌（Endophytic microbe）

內(nèi)生細(xì)菌一般位于宿主植物表皮細(xì)胞層下方組織中且不具有固氮作用，在長期的共同進(jìn)化過程中內(nèi)生細(xì)菌能夠幫助宿主植物適應(yīng)外界環(huán)境脅迫。蒼白桿菌屬（Ochrobactrumsp.）菌株R24是從雙酚A污染濕地生長的短尖燈心草（Juncus acutus）根部分離到的內(nèi)生細(xì)菌，將其接種至盆栽短尖燈心草后發(fā)現(xiàn)能顯著提高植物攝取重金屬Zn和Ni的能力［20］。沙雷氏菌屬（Serratia）菌株RSC-14能夠提高龍葵（Solanum nigrum）對Cd的耐受指數(shù)（Tolerance index，TI），還能夠促進(jìn)Cd在龍葵根部和莖段的積累［21］。內(nèi)生細(xì)菌不僅強(qiáng)化單一重金屬污染土壤的植物修復(fù)能力，同時(shí)對復(fù)合污染土壤具有強(qiáng)化效果。如惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）W619-TCE不僅能夠減輕復(fù)合污染物Ni-三氯乙烯對楊樹的毒害作用，同時(shí)增強(qiáng)了楊樹根部對Ni的攝取能力和加強(qiáng)了三氯乙烯的蒸騰作用［22］。內(nèi)生細(xì)菌在增強(qiáng)宿主對重金屬脅迫的耐受性、促進(jìn)超富集植物生物量增加及加速植物修復(fù)進(jìn)程等方面具有重要價(jià)值［23］。

2 螯合劑強(qiáng)化植物修復(fù)能力

螯合劑能夠與重金屬結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)土壤重金屬成為可溶態(tài)，從而有效地增加重金屬的生物利用度，強(qiáng)化植物修復(fù)效率。目前用于強(qiáng)化植物修復(fù)的螯合劑有傳統(tǒng)的乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid，EDTA），新型可生物降解的乙二胺二琥珀酸（S，S-ethylenediaminedisuccinic acid，EDDS） 和 谷 氨 酸 N，N-二 乙 酸（N，N-bis（carboxymethyl）glutamic acid，GLDA），以及根際微生物或植物合成并分泌的小分子有機(jī)酸（Small molecular organic acids，SMOA）等，這些化合物在諸多報(bào)道中均體現(xiàn)出強(qiáng)化植物修復(fù)能力。

2.1 乙二胺四乙酸

螯合劑在提高土壤中重金屬的溶解度，增強(qiáng)植物修復(fù)效率具有顯著的促進(jìn)作用。EDTA能夠極顯著地促進(jìn)印度芥菜（B. juncea）對Pb的吸收，其中地上部分中Pb的含量較對照提高了75倍，這主要是因?yàn)椴豢扇艿腜b在EDTA的螯合作用下形成了可溶性的Pb-EDTA形式，從而促進(jìn)了植物對Pb的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)［24］。EDTA有助于Pb在土壤中溶解從而增加生物利用度，藍(lán)桉（Eucalyptusglobulus）在EDTA的作用下能夠提高Pb吸收能力5倍，植物中Pb的含量可達(dá)700 mg/kg［25］。EDTA因其能夠促進(jìn)土壤中重金屬流動(dòng)性提高了其生物利用度，從而能夠快速有效地增強(qiáng)植物修復(fù)效率，然而正是這一特性也可能導(dǎo)致重金屬高流動(dòng)性擴(kuò)散對未污染環(huán)境造成風(fēng)險(xiǎn)［26］。因此，開發(fā)對環(huán)境友好、能夠生物降解的螯合劑是一個(gè)新的趨勢。

2.2 乙二胺二琥珀酸

近年來螯合劑EDDS因其具有很強(qiáng)的金屬螯合能力和可快速生物降解的特性而在生物修復(fù)中被廣泛使用。Attinti等［27］對土壤及滲濾液分析結(jié)果顯示EDDS能夠促進(jìn)土壤中Pb的溶解，同時(shí)能夠促進(jìn)香根草（Chrysopogon zizanioides）對Pb的攝取以及向地上部分轉(zhuǎn)運(yùn)。分別用EDDS和EDTA處理重金屬污染土壤中的向日葵，結(jié)果顯示EDDS比EDTA更加有效地增強(qiáng)了向日葵提取重金屬的能力［28］。

2.3 谷氨酸N,N-二乙酸

GLDA對多種金屬都顯示出很好的螯合能力，同時(shí)具有良好的生物降解性能，研究表明在28 d內(nèi)GLDA的降解率達(dá)到60%［29］。GLDA在處理工業(yè)污泥中能夠有效地提取重金屬Cd、Ni和Cu［30］。用GLDA處理龍葵后發(fā)現(xiàn)能分別提高植株提取Cu、Cd和Zn的能力約1.8倍，而與IAA混合處理后能進(jìn)一步增強(qiáng)植物對重金屬的提取能力［31］。

2.4 小分子有機(jī)酸

植物或微生物通常能夠分泌如檸檬酸、草酸和蘋果酸等小分子量的有機(jī)酸到根際土壤中，這些來自于三羧酸循環(huán)途徑的SMOA在促進(jìn)植物生長（如溶磷、增強(qiáng)土壤酶活性）、緩解重金屬脅迫（如螯合重金屬）等方面具有重要作用［26，32］。研究表明龍葵（S.nigrum）葉片中有機(jī)酸的含量與可溶性Cd的含量呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)性，而另一茄科植物茄子（Solanummelongena）葉片中的有機(jī)酸含量較低，這一結(jié)果暗示了有機(jī)酸對重金屬在植物中積累存在重要作用［33］。在檸檬酸處理下能夠顯著提高歐洲油菜（Brassica napus）對高濃度Cu的耐受性，同時(shí)增加Cu在植物中的積累［34］。Ni在超富集植物遏藍(lán)菜屬的Thlaspigoesingense葉片中主要以Ni-有機(jī)酸復(fù)合物的形式儲存在細(xì)胞液泡中［35］，而Zn在超富集植物葉芽鼠耳芥（Arabidopsis halleri）的根部主要是以蘋果酸鋅和檸檬酸鋅等有機(jī)酸鋅的形式存在［36］。因此，向植物外源添加SMOA對強(qiáng)化植物修復(fù)重金屬能力具有重要的作用。此外，誘導(dǎo)植物胞內(nèi)合成SMOA可以進(jìn)一步促進(jìn)植物細(xì)胞內(nèi)的重金屬區(qū)隔化，有效地起到了緩解重金屬對植物的毒害作用。

3 基因工程手段強(qiáng)化植物修復(fù)能力

隨著分子生物學(xué)和生物化學(xué)研究的深入，越來越多的蛋白或多肽參與了如重金屬螯合、重金屬植物毒性緩解、重金屬胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等植物修復(fù)步驟。因此，在微生物或植物中表達(dá)編碼這些蛋白的基因能夠有效地增強(qiáng)植物修復(fù)能力。

3.1 基因工程改良微生物強(qiáng)化植物修復(fù)能力

采用基因工程手段在微生物中表達(dá)外源基因，能夠有效增強(qiáng)微生物處理重金屬污染的能力。在豆科植物紫云英（Astragalus sinicus）共生菌華癸中生根瘤菌（Mesorhizobium huakuii）變種B3中表達(dá)擬南芥植物螯合肽編碼基因AtPCS能夠促使微生物攝取Cd能力提高9-19倍，將重組根瘤菌B3接種至紫云英后，能促進(jìn)宿主對Cd的吸收［37］。將改造的編碼人金屬硫蛋白四聚體基因MTL4和來源于擬南芥植物螯合肽編碼基因AtPCS同時(shí)導(dǎo)入B3，并將此重組菌侵染紫云英，結(jié)果顯示種植在Cd污染稻田土壤中的紫云英根部Cd的含量較對照提高了3倍［38］。將來源于擬南芥的鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtIRT1分別與MTL4或AtPCS導(dǎo)入B3菌株，侵染宿主后結(jié)果顯示導(dǎo)入雙基因組合（AtIRT1+MTL4或AtIRT1+AtPCS）重組根瘤菌B3均能促進(jìn)宿主紫云英吸收Cu和As的能力［39］。在惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）中表達(dá)金屬結(jié)合肽編碼基因EC20不僅顯著提高重組菌結(jié)合Cd的能力，并且降低了Cd對細(xì)胞的毒性；與向日葵共生后Cd在宿主根部積累的濃度較對照提高了40%［40］。因此，采用基因工程手段在根際微生物中表達(dá)與重金屬共價(jià)結(jié)合的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或合成分泌到細(xì)胞外與重金屬結(jié)合的螯合肽，均能夠有效強(qiáng)化微生物-植物共生體系提取重金屬的能力。

3.2 植物修復(fù)能力的基因工程改造

根據(jù)基因編碼蛋白生物學(xué)功能的不同，目前利用植物基因工程強(qiáng)化植物修復(fù)能力主要的基因編碼蛋白為金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、金屬硫蛋白、植物螯合肽合成酶、谷胱甘肽合成酶、金屬裂解酶及金屬還原酶等（表1）。金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要包含以下幾個(gè)家族：重金屬ATPase家族、NRAMP家族、CDF家族及ZIP家族等。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在重金屬被植物提取、易位和區(qū)隔化均起到了重要的作用。超富集植物天藍(lán)遏藍(lán)菜（Thlaspi caerulescens）對Zn的攝取速率是同屬非超富集植物菥蓂（Thlaspi arvense）的4.5倍，導(dǎo)致這一差異的關(guān)鍵是天藍(lán)遏藍(lán)菜根部ZIP家族成員ZNT1組成型高度表達(dá)［41-42］。金屬硫蛋白是一類由基因編碼富含半胱氨酸且對重金屬具有高親和力的多肽。在擬南芥中表達(dá)來源于金屬硫蛋白編碼基因copC能夠有效地促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株對Cu的積累［43］。金屬螯合肽是以谷胱甘肽（或其同系物）為底物通過金屬螯合肽合成酶的催化合成的小肽。在煙草中表達(dá)外源基因AtPCS1能夠增強(qiáng)植株對重金屬Cd和As的耐受性，并促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株對Cd的吸收［44］。谷胱甘肽的生物合成依賴GSHI和GSHII的表達(dá)，在擬南芥或芥菜中過表達(dá)谷胱甘肽合成途徑基因，能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因植株對Cd的耐受性和吸收能力［45-46］。有機(jī)汞是能夠?qū)е律窠?jīng)退變一類嚴(yán)重的劇毒污染物，在擬南芥中表達(dá)來自于細(xì)菌的有機(jī)汞裂解酶MerB能夠催化碳-汞鍵斷裂，游離出毒性大大降低的Hg0［47］。在擬南芥中同時(shí)表達(dá)有機(jī)汞還原酶基因MerA和MerB能夠有效地提高植株對有機(jī)汞毒性的耐受能力，較對照的耐受濃度提高了50倍［48］。此外，在植物中表達(dá)與植物螯合素（煙酰胺、多聚磷酸等）合成相關(guān)酶能夠促進(jìn)植物對重金屬的耐受性，同時(shí)增強(qiáng)植物提取重金屬的能力［49-50］。隨著對重金屬耐受、體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等分子機(jī)制研究的深入，將會有越來越多的基因可以用于強(qiáng)化植物修復(fù)能力。

4 強(qiáng)化植物修復(fù)能力的機(jī)制

微生物、螯合劑及外源基因是目前強(qiáng)化植物修復(fù)的3個(gè)主要措施，越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)這些強(qiáng)化因子主要是通過以下3種機(jī)制強(qiáng)化了植物修復(fù)能力。

4.1 微生物促進(jìn)植物生長

利用植物進(jìn)行重金屬污染土壤修復(fù)的前提條件必須是能夠在污染土壤中生長且有足夠高的生物量。微生物-植物共生體系中的相互交流是構(gòu)建根際層的關(guān)鍵過程，在此過程中微生物以多種方式降低重金屬對植物的脅迫來促進(jìn)植物的生長［23］。

4.1.1 充當(dāng)生物菌肥為植物提供營養(yǎng) 以固氮菌和溶磷微生物為代表的促進(jìn)植物生長菌（Plant growth promoting bacteria，PGPB）在可持續(xù)性生態(tài)農(nóng)業(yè)上作為生物菌肥具有廣泛的應(yīng)用。大氣中的N2在固氮菌的作用下可以轉(zhuǎn)化為植物可直接利用的NH3形式，從而促進(jìn)植物對N元素的攝取。固氮菌與十字花科植物家獨(dú)行菜（Lepidium sativumL.）共生后不但顯著提高了宿主的生物量，同時(shí)促進(jìn)了種子萌發(fā)、根長以及莖段長度，從而增強(qiáng)了宿主對Cd和Cr的耐受能力［51］。植物能利用土壤中的含量僅為1 ppm甚至更低的可溶性P，而溶磷微生物將磷酸三鈣、磷酸二鈣或羥基磷灰石等不可溶無機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可溶性P供給植物生長［52］。

4.1.2 增強(qiáng)宿主抵御病原微生物能力 根際微生物通過分泌鐵載體、抗生素和氰化物等抑制病原微生物侵入植物。鐵載體是植物從環(huán)境中獲得Fe的主要來源，當(dāng)缺少合成鐵載體的微生物時(shí)，植物會表現(xiàn)出鐵缺乏癥；而鐵載體另外一個(gè)重要生物學(xué)功能就是減少病原微生物的鐵生物利用度，從而作為生物防治劑殺死病原微生物［53］。

4.1.3 分泌1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）脫氨酶促進(jìn)植物生長發(fā)育 ACC是植物激素乙烯生物合成途徑中的直接生化前體，在ACC脫氨酶催化下合成α-酮丁酸，從而降低了植物胞內(nèi)的乙烯水平，最終改善極端環(huán)境條件（如重金屬脅迫）下植物的生長和發(fā)育［54］。

4.1.4 合成植物所需的生長激素及維生素 微生物能夠合成并分泌植物激素（如IAA等）促進(jìn)宿主植物吸收營養(yǎng)和生物量的增加［23］。此外，IAA還能夠有效促進(jìn)土壤酶和微生物群落活性［55］，進(jìn)一步增強(qiáng)微生物-植物體系生物修復(fù)的能力；水溶性B族維生素如煙酰胺、硫胺素等作為輔酶廣泛參與細(xì)胞的生命活動(dòng)，因而是生物體生長發(fā)育必不可少的生長因子。微生物能夠利用簡單的碳源和氮源合成豐富的維生素［56］，維生素不僅促進(jìn)植物的生長，同時(shí)也會以非直接的方式影響土壤中固氮菌的生物量［57］。超富集植物生物量是影響生物修復(fù)效率的重要因子，而根際微生物在營養(yǎng)輸送、激素水平調(diào)節(jié)和增強(qiáng)抗逆性等方面為宿主植物的生長提供了重要保障。

表1 基因工程策略增強(qiáng)植物修復(fù)能力

4.2 緩解重金屬植物毒性

生長在重金屬污染土壤中的植物通常會受到不同程度的傷害，如重金屬誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS升高導(dǎo)致脂質(zhì)氧化、打破胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)、電子傳遞鏈紊亂等，從而致使植株生長發(fā)育受到限制甚至死亡［58］。雖然重金屬脅迫狀態(tài)下的植物能夠通過限制重金屬吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)、螯合固定、激活水楊酸信號通路、表達(dá)過氧化物酶等策略來緩解重金屬的毒害作用［59］。然而植物修復(fù)強(qiáng)化因子如微生物、螯合劑或基因編碼蛋白等可以為植物抵御重金屬脅迫做出重要的補(bǔ)充。

4.2.1 增強(qiáng)植物過氧化物酶活性清除ROS 通常重金屬脅迫顯著提高植物胞內(nèi)ROS的生成速率，而抗氧化機(jī)制能夠有效地幫助植物抵御ROS對細(xì)胞的毒害作用。Wan等［60］發(fā)現(xiàn)微生物嗜線蟲沙雷氏菌（Serratia nematodiphila）菌株LRE07會導(dǎo)致宿主龍葵（S.nigrum）抗氧化酶CAT、APX和GPX的活性增強(qiáng)，從而有效地提高了植物在高濃度Cd土壤中的生存能力。

4.2.2 表達(dá)谷胱甘肽緩解重金屬脅迫 細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽不僅能夠直接清除ROS，并且能夠作為底物合成生物螯合肽，因此在植物響應(yīng)重金屬脅迫進(jìn)程中起到至關(guān)重要的作用；轉(zhuǎn)錄組研究顯示受到重金屬脅迫的楊樹葉片中基因表達(dá)模式發(fā)生顯著改變，其中參與GSH生物合成途徑的基因表達(dá)水平是最高的，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了谷胱甘肽的重要性［61］。

4.2.3 降低重金屬毒性的生物轉(zhuǎn)化 在重金屬脅迫下微生物能夠分泌金屬氧化還原酶或甲基化酶等改變重金屬離子形式，從而降低重金屬對生物的毒害作用。微生物arsC基因的表達(dá)將砷酸鹽As（V）還原為為低毒性的亞砷酸鹽As（III），從而降低了As對植物的傷害［62］。

4.2.4 鐵載體螯合重金屬 鐵載體是對Fe離子具有最高的親和力的有機(jī)小分子，同時(shí)鐵載體也能夠與其他重金屬離子形成復(fù)合物。Shin等［63］從超積累植物旅順榿木（Alnus firma）中分離到一株產(chǎn)鐵載體芽孢桿菌MN3-4，將其接種到歐洲油菜（Brassica napus）后發(fā)現(xiàn)能夠顯著降低Pb的植物毒性。一個(gè)合理的解釋是重金屬能夠抑制植物生長激素如IAA的合成，由于微生物分泌的鐵載體能夠螯合重金屬，因而很大程度地保護(hù)了植物激素合成能力和維持植物激素正常水平［64］。

4.2.5 金屬硫蛋白或植物螯合肽參與的區(qū)隔化作用 重金屬進(jìn)入植物體內(nèi)會與金屬硫蛋白或植物螯合肽形成復(fù)合物，后者通過生物膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以進(jìn)入液泡、高爾基體將重金屬進(jìn)行區(qū)隔化，從而降低重金屬植物毒害作用［65］。

雖然在重金屬脅迫時(shí)，植物本身要作出積極地應(yīng)答，如植物細(xì)胞壁酚類物質(zhì)的合成固定重金屬、金屬離子通道外排或阻斷運(yùn)輸?shù)?；而微生物、外源基因等?qiáng)化因子通過上述機(jī)制進(jìn)一步緩解重金屬對植物的毒害作用，其中金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、金屬裂解酶和金屬還原酶等代表生物學(xué)功能的解析將進(jìn)一步豐富生物修復(fù)的理論體系。

4.3 提高重金屬生物利用度

由于重金屬不溶性和土壤束縛重金屬等特性，植物修復(fù)效率很大程度上受到了低生物利用度的制約［66］。在土壤中金屬的生物利用度的高低取決于多方面的因素如土壤pH值、氧化還原電位、金屬離子形式等［67］。一般而言，土壤中pH值越高時(shí)金屬的溶解度越低，因此土壤酸化很大程度上提高了重金屬生物利用度。植物及其根際微生物向根際土壤分泌有機(jī)酸、質(zhì)子等物質(zhì)促進(jìn)土壤酸化，有研究表明根際土壤的pH值較非根際土壤低2-3個(gè)單位［68］。此外，有機(jī)酸能夠直接影響重金屬的可溶性，如固氮菌能夠?qū)⑵咸烟茄苌鸀?-酮基葡萄糖酸，該有機(jī)酸對土壤中Zn化合物的溶解起到了重要作用［69］。內(nèi)生細(xì)菌能夠合成糖脂、磷脂、多聚糖等生物表面活性劑，這類小分子兩性化合物能夠降低表面張力，從土壤粒子中解離重金屬離子并與之結(jié)合成復(fù)合物，從而增加其可溶性和生物利用度［23］。螯合劑能夠?qū)⒔饘購耐寥阑|(zhì)中解吸附，促進(jìn)金屬游離至根際供給植物根部吸收。例如，EDTA能夠分別增加土壤中的Pb和Cd的溶解度13.1倍和3.1倍，有效地增強(qiáng)了植物對重金屬的提取能力［70］；不同的螯合劑表現(xiàn)出對重金屬不同的轉(zhuǎn)運(yùn)能力和易位方式，在含硝酸鉛營養(yǎng)液中培養(yǎng)豌豆（Pisum sativum）分別加入螯合劑EDTA和EDDS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對EDDS而言EDTA具有更強(qiáng)促進(jìn)豌豆吸附Pb的能力以及將Pb從根轉(zhuǎn)運(yùn)到苗的能力。此外，電鏡結(jié)果顯示Pb-EDTA主要存在根尖部位而Pb-EDDS沿著根均勻分布，這些結(jié)果揭示不同的螯合劑采用了不同的運(yùn)輸方式對重金屬進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)［71］?？傊⑸?植物共生體系通過分泌有機(jī)酸、質(zhì)子、生物表面活性劑等物質(zhì)以及外源直接添加化學(xué)螯合劑均能有效促進(jìn)重金屬的溶解，土壤重金屬通過這些方式快速動(dòng)員到植物根系周圍并被植物提取與轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，提高重金屬生物利用度能夠顯著強(qiáng)化植物修復(fù)能力。

5 展望

隨著重金屬污染環(huán)境問題日益加重，植物修復(fù)技術(shù)因其綠色環(huán)保、經(jīng)濟(jì)有效而被視為重金屬污染土壤修復(fù)的重要技術(shù)手段之一。盡管有諸如蜈蚣草修復(fù)砷污染土壤的應(yīng)用示范，然而更多的研究成果依然受限于植物生物量低下、修復(fù)耗時(shí)過長等因素而不能應(yīng)用于實(shí)踐。因此，采用合理的措施強(qiáng)化植物修復(fù)技術(shù)的效率可能是解決該矛盾的關(guān)鍵之一。例如，建立穩(wěn)定和諧的微生物-植物共生體系能夠有效地促進(jìn)植物生長和增強(qiáng)宿主植株的抗逆性，不僅保障了植物生物量在重金屬污染的土壤環(huán)境中穩(wěn)定增加，而且微生物對重金屬的吸附能夠進(jìn)一步強(qiáng)化富集植物對重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)；采用可生物降解的螯合劑或根際微生物分泌出的小分子有機(jī)酸等促進(jìn)土壤中重金屬的可溶性和流動(dòng)性，從而強(qiáng)化重金屬的生物利用度，最終導(dǎo)致更多的重金屬從土壤中轉(zhuǎn)移到富集植物中；編碼植物細(xì)胞解毒和金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的應(yīng)用能夠進(jìn)一步強(qiáng)化富集植物對重金屬毒害的耐受能力，從而能夠高效地從土壤中攝取重金屬離子并能夠在體內(nèi)存儲更高濃度的重金屬。然而在強(qiáng)化策略的實(shí)施過程中，一些強(qiáng)化策略仍需考察其可能存在的負(fù)面效應(yīng)。如轉(zhuǎn)基因微生物的可控性與安全性，即具有更強(qiáng)吸收重金屬能力的轉(zhuǎn)基因微生物進(jìn)入環(huán)境后時(shí)是否會侵染農(nóng)作物，導(dǎo)致更多的重金屬進(jìn)入食物鏈。螯合劑的使用可能造成的重金屬過度游離，從而可能對相鄰?fù)寥涝斐晌廴尽Ｍㄟ^強(qiáng)化手段導(dǎo)致更多的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)到植物地上部分，這對草食動(dòng)物和傳媒昆蟲生理的影響也值得深入研究。這些問題的解決不僅能夠深入解析植物修復(fù)的生理生化機(jī)制，而且更有利于推動(dòng)植物修復(fù)技術(shù)廣泛應(yīng)用于重金屬污染土壤修復(fù)。