解磷菌發(fā)酵及溶磷條件的研究

韓蕾 楊樂 唐金銘 張雅倩

（石河子大學農(nóng)學院，石河子 832000）

磷是除氮外限制植物生長的主要營養(yǎng)元素，在能量代謝、光合作用、營養(yǎng)物質(zhì)轉運和遺傳特性中起著至關重要的作用［1-2］。土壤是植物吸收磷的主要庫源，但絕大部分以 Ca3（PO4）2、CaHPO4、FePO4和AlPO4等難溶性磷存在，難以被植物吸收利用［3］。我國約74%的耕地土壤缺磷，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)主要以施用化學磷肥供給有效磷，而施入土壤的磷肥除小部分被作物吸收外，75%-90%與土壤中Ca2+、Fe3+、Al3+等陽離子反應沉積在土壤中，導致土壤磷素不斷積累，而有效磷缺乏，這不僅會造成有限的磷礦資源大量浪費，而且還會加劇農(nóng)業(yè)面源污染問題［4-6］。根據(jù)農(nóng)業(yè)部“一控兩減三基本”的要求，如何有效利用土壤中固定的難溶性磷，提高磷肥的利用率，從而減少磷化肥的施用量，對解決土壤中磷的供需矛盾具有重要意義。

土壤微生物是土壤養(yǎng)分循環(huán)轉化的動力，解磷菌能夠通過分泌有機酸、無機酸、嗜鐵素、H2S、腐殖質(zhì)、磷酸酶及胞外多糖等物質(zhì)，或NH4+同化作用將土壤中無效磷轉化為植物可利用的有效磷，可提高磷肥利用率、改善土壤結構和促進作物生長［7-10］。目前已發(fā)現(xiàn)的解磷細菌主要有無色桿菌屬、氣桿菌屬、芽孢桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、沙雷菌屬、黃單胞菌屬、克雷伯菌屬、氣單胞菌屬和腸桿菌屬等［11-12］。然而，解磷菌施用于土壤效果受到菌株定殖競爭能力和環(huán)境條件影響，尤其是石灰性鹽化土壤，其固定的難溶性磷酸鹽主要以磷酸鈣的形態(tài)存在，因此，需篩選適應新疆鹽堿土環(huán)境的具有溶磷特性的微生物。此外，解磷菌的數(shù)量是其前期定殖和競爭的基礎，新疆主要采用滴管、噴灌等方式，一般肥料隨水進入作物根區(qū)，為解磷菌以發(fā)酵液形式進入土壤奠定了基礎，也便于其在作物根部定殖、生長和溶磷?；诖?，以鹽堿土中分離純化得到一株高效解磷菌PS-3為研究對象，采用單因素和正交試驗，研究菌株PS-3的發(fā)酵條件，考察碳源、氮源、pH、溫度、鹽度和接種量對菌株PS-3溶解磷酸三鈣的影響，為新疆鹽堿土磷素的有效性釋放和合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：PS-3為本實驗室從新疆鹽堿土中篩選獲得。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

國際植物研究所磷酸鹽生長培養(yǎng)基（National Botanical Research Institute’s phosphate growth medium，NBRIP）［13］：葡萄糖 10 g，Ca3（PO）25 g，MgCl2·6H2O 5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，（NH4）2SO40.1 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株PS-3發(fā)酵條件的研究 將菌株PS-3接入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)22 h，以1%的接種量投加至新鮮LB培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)體系的溫度（15-45℃）、初始pH（4-10）和鹽濃度（0-7%），同時以不接菌的LB培養(yǎng)基為對照，每個處理重復3次，分別置于120 r/min振蕩培養(yǎng)，測定發(fā)酵液的OD600。

1.2.2 菌株PS-3溶磷條件的優(yōu)化

1.2.2.1 碳源和氮源的影響 分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖為NBRIP中唯一碳源（1%），其他培養(yǎng)基成分不變，按2%的接種量接種菌株PS-3，于35℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，以不接菌的為對照，每個處理重復3次，10 000 r/min離心10 min取上清液，采用鉬銻抗比色法［14］測定有效磷含量，篩選出最適碳源后進行濃度優(yōu)化（0.5%-5%）。在此基礎上，以硝酸鈉、尿素、硝酸銨及氯化銨為氮源等量替換硫酸銨，研究不同氮源對菌株PS-3溶磷的影響，并優(yōu)化氮源添加量（0.005%-0.05%）。

1.2.2.2 環(huán)境因素對菌株PS-3溶磷的影響 將發(fā)酵培養(yǎng)22 h的菌株PS-3制成菌懸液，按2%的接種量投加至優(yōu)化的NBRIP中，分別調(diào)節(jié)體系的溫度（20、25、30、35和 40℃）、初始 pH（5、6、7、8和 9）和鹽濃度（2 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、30 g/L和50 g/L），在120 r/min培養(yǎng)7 d，同時以不接菌的為對照，每個處理3次重復，以鉬銻抗比色法測定有效磷含量。

1.2.2.3 正交試驗 采用L16（44）設計正交試驗進一步優(yōu)化菌株PS-3的溶磷能力，以不接菌的為對照，每個處理重復3次，試驗設計見表1。

表1 正交試驗因素水平

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進行統(tǒng)計分析和顯著性檢驗。

2 結果

2.1 菌株PS-3發(fā)酵條件的研究

通過搖瓶發(fā)酵試驗，考察溫度、pH和鹽濃度對菌株生長的影響，結果見圖1。由圖1-A可知，隨著溫度的升高，菌株PS-3的OD600值呈現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象，在15-45℃范圍內(nèi)均能生長，35℃為最適生長溫度，而當溫度低于25℃或高于40℃時，菌株生長緩慢，數(shù)量顯著下降（P＜0.05），這可能是由于環(huán)境溫度過高時，會使微生物蛋白質(zhì)失活死亡，而溫度較低時，酶的活性降低，影響微生物的生長繁殖。菌株PS-3對酸堿的耐受性較好，在pH值5.0-9.0的范圍內(nèi)均能生長，最適pH值為7，而當pH低于6或高于8時，菌株PS-3的生長才會受到明顯抑制（圖1-B）。

滲透壓會影響微生物的生長，結果見圖1-C。隨著NaCl濃度增加，菌株PS-3的OD600值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且差異顯著（P＜0.05）。菌株PS-3最適生長鹽濃度為1%，在鹽濃度為0-5%范圍內(nèi)均能生長，這可能與菌株PS-3從鹽堿土中分離有關，而當鹽濃度達到7%時基本不能生長。綜上所述，菌株PS-3的較適發(fā)酵條件為溫度35℃、pH 7、鹽濃度1%。

2.2 菌株PS-3溶磷條件的優(yōu)化

2.2.1 碳源對菌株PS-3溶磷的影響 碳源對菌株PS-3溶磷效果的影響，結果見圖2。由圖可知，不同碳源對菌株PS-3溶解磷酸三鈣的能力有差異，溶液中有效磷含量大小依次為葡萄糖＞麥芽糖＞果糖＞蔗糖＞乳糖。以葡萄糖和麥芽糖為碳源時，溶液中有效磷含量在470 mg/L以上，顯著高于果糖、蔗糖、乳糖（P＜0.05），其中，葡萄糖為碳源時，菌株PS-3溶磷能力最強，溶液中有效磷含量可達539.19 mg/L，而當碳源為乳糖時，菌株PS-3溶磷效果最差，有效磷含量僅僅為20.50 mg/L，可能是由于乳糖的代謝途徑更為復雜，菌株PS-3不能很好地利用乳糖。

圖2 碳源對菌株PS-3溶磷的影響

在此基礎上，以葡萄糖作為碳源，考察葡萄糖濃度對菌株PS-3溶磷效果的影響，結果如圖3所示。由圖可以看出，隨著葡萄糖濃度增加，溶液中有效磷濃度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，且差異顯著（P＜0.05），菌株PS-3溶磷最適的葡萄糖濃度為2%。2.2.2 氮源對菌株PS-3溶磷的影響 由圖4可看出，菌株PS-3以硝酸銨為氮源時，有效磷含量為706.67 mg/L；以氯化銨、硫酸銨和硝酸鈉為氮源時，有效磷含量均超過648 mg/L，但無顯著差異（P＞0.05）；以尿素為氮源時，有效磷含量最低；菌株PS-3對氮源的利用順序依次為硝酸銨＞硝酸鈉＞氯化銨＞硫酸銨＞尿素，這表明該菌株以硝態(tài)氮為氮源時較銨態(tài)氮對磷有更好的溶解能力，這可能與菌株PS-3代謝途徑有關。

圖3 葡萄糖濃度對菌株PS-3溶磷的影響

圖4 氮源對菌株PS-3溶磷的影響

圖5 硝酸銨濃度對菌株PS-3溶磷的影響

在優(yōu)化碳、氮源的基礎上，考察硝酸銨濃度對菌株PS-3溶磷效果的影響，結果見圖5。由圖可知，隨著硝酸銨濃度增加，溶液中有效磷含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當其濃度達到0.01%時，溶液中有效磷含量最高，而硝酸銨繼續(xù)增加時，溶液中有效磷含量開始下降，且差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 溫度對菌株PS-3溶磷的影響 由圖6可以看出，溫度對菌株PS-3溶解磷酸三鈣的影響不明顯，在20-40℃范圍內(nèi)均具有良好的溶磷能力，當溫度從20℃上升至35℃時，菌株PS-3對磷的溶解能力增加了11.86%，在溫度達到35℃后，菌株PS-3溶磷能力逐漸降低，但差異不顯著（P＞0.05），這表明菌株PS-3具有一定的耐溫性。

圖6 溫度對菌株PS-3溶磷的影響

2.2.4 初始pH對菌株PS-3溶磷的影響 由圖7可知，菌株PS-3在pH 5-9的范圍內(nèi)均能溶解磷酸三鈣，具有較強的適應能力，尤其是在pH值6-8的環(huán)境中，溶液中有效磷含量均超過750 mg/L；而pH高于8時，溶液中有效磷含量顯著降低（P＜0.05），可能是由于體系中堿性較強，溶磷菌分泌的有機酸量有限，影響了溶磷效果。

圖7 初始pH值對菌株PS-3溶磷的影響

2.2.5 鹽濃度對菌株PS-3溶磷的影響 隨著鹽濃度上升，溶液中有效磷含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢（圖8）。菌株PS-3在NaCl濃度為0-5%范圍內(nèi)均能溶磷，鹽濃度為0.2%時，溶磷量達到最高，含鹽量在2%以內(nèi)基本不影響菌株的溶磷能力，能夠適應新疆鹽漬化土壤環(huán)境；而鹽濃度超過3%時，溶液中有效磷含量顯著下降（P＜0.05），菌株PS-3溶磷能力受到了明顯的抑制。

圖8 鹽濃度對菌株PS-3溶磷的影響

2.2.6 正交試驗 對菌株PS-3進行4因素4水平正交試驗，結果見表2。由K值和極差R大小可知，4個因素對菌株PS-3溶磷效果的影響主次順序為鹽濃度＞接種量＞ pH＞溫度。正交試驗初步得到的最優(yōu)溶磷條件為pH 7.5、溫度35℃、鹽濃度2 g/L，接種量4%。在最優(yōu)溶磷條件下，驗證實驗結果表明該菌株在7 d的溶磷量可達100 2.95 mg/L。

3 討論

在土壤磷循環(huán)過程中，解磷微生物起著重要的作用，它可以將土壤中的難溶性磷轉化為植物能夠吸收利用的有效磷，提高磷肥的利用率、改良土壤結構和提高作物產(chǎn)量［15-18］。解磷菌自身特性和環(huán)境因素會影響其溶磷效果。本研究中篩選的解磷菌PS-3來自于新疆鹽堿地，具有一定的耐鹽脅迫能力，在鹽濃度為5%時仍可生長，其對磷酸三鈣的溶磷量可達127.61-1 002.95 mg/L。江紅梅等［19］從內(nèi)蒙古鹽堿地中篩選得到的解磷菌M1可耐受10% NaCl。向文良等［20］從四川鹽井分離的中度嗜鹽菌QW1011可在15% NaCl中生長，其溶磷能力可達56.76-71.34 mg/L。胡山等［21］從河西走廊鹽堿地分離的解磷菌Y3-35也具有一定的耐鹽性，在鹽濃度為0.25%時溶磷量可高達723.34 mg/L，這說明了鹽堿土中的解磷微生物具有一定的耐鹽能力。與上述耐鹽解磷菌相比，本研究中的菌株PS-3具有較強的溶磷能力。

表2 L16（44）正交試驗結果

研究表明，培養(yǎng)基中碳氮源會影響解磷菌的生長，并通過改變其產(chǎn)生的有機酸類型和濃度影響溶磷效果［22-23］。衛(wèi)星［24］等研究發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源時，巨大芽孢桿菌NCT-2的溶磷量可達93.34 mg/L；黃達明等［25］的洋蔥伯克霍爾德氏菌P0417以葡萄糖、草酸銨為碳氮源時，其溶磷量可達791.84 mg/L；Jain等［23］分離的溶磷菌S29優(yōu)先利用乳糖和硫酸銨，其對磷酸三鈣的溶解量高達1 110 mg/L。本研究中的菌株PS-3在不同碳氮源條件下的溶磷量也存在差異，當葡萄糖為碳源、硝酸銨為氮源時，該菌株 7 d優(yōu)化的溶磷量可達到1 002.95 mg/L，這與李海云等［26］的研究結果一致。從新疆鹽堿土中分離出具有一定耐鹽解磷能力的菌株，這為新疆鹽堿土磷素的有效性釋放和合理利用提供理論依據(jù)，對區(qū)域農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。后續(xù)研究中，將對解磷菌PS-3的解磷機理及其在土壤中的定殖能力、溶磷效果等方面做進一步研究。

4 結論

菌株PS-3具有一定的耐酸堿、溫度和鹽度能力，在pH 5-9、15-45℃、NaCl濃度0-5%范圍內(nèi)均可生長。菌株PS-3的較適發(fā)酵條件為溫度35℃、pH 7，鹽濃度1%。

不同碳源和氮源會影響菌株PS-3的溶磷效果，其對碳源的利用順序依次為葡萄糖＞麥芽糖＞果糖＞蔗糖＞乳糖，對氮源的利用順序依次為硝酸銨＞硝酸鈉＞氯化銨＞硫酸銨＞尿素。菌株PS-3在pH 5-9，20-40℃，NaCl濃度0-5%范圍內(nèi)對磷酸三鈣有一定的溶解能力。

通過單因素和正交試驗對菌株PS-3的溶磷條件進行了優(yōu)化，獲得最適條件為2%葡萄糖、0.01%硝酸銨、溫度35℃、初始pH 7.5、鹽濃度2 g/L、接種量4%，在此條件下，其對磷酸三鈣的溶解量可達1 002.95 mg/L。