牦牛miR-378前體克隆及組織表達(dá)分析

紀(jì)會 王會 柴志欣 王吉坤 羅曉林 姬秋梅 信金偉 鐘金城

（1. 西南民族大學(xué) 青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2. 四川省草原科學(xué)研究院，成都 611731；3. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，拉薩 850009）

microRNA（miRNA）是一類長約20-25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，以互補(bǔ)配對的方式與靶基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA結(jié)合，引導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RICS）清除 mRNA［1］或抑制 mRNA 的翻譯［2］，從而影響編碼蛋白基因的表達(dá)。miRNA 最先在秀麗線蟲中被發(fā)現(xiàn)［3］，廣泛存在于哺乳動物、果蠅和植物等生物中。miRNA基因盡管不編碼蛋白，但在生物整個(gè)生命活動中發(fā)揮著重要作用，參與細(xì)胞的分裂增殖、分化、生物發(fā)育及代謝等多個(gè)生物學(xué)過程［4］，并在疾病發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。

miR-378最初在人白血病細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)［5］，miR-378家族有許多成員，牛的miR-378（bta-miR-378）家族有3種高度同源的類型：bta-miR-378b（MIMAT0025535）和 bta-miR-378c（MIMAT0025551）、bta-miR-370d（MIMAT0036972）。研究表明，miR-378參與各種癌癥的多種生物學(xué)過程，在前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌的研究中miR-378可以抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移［6-8］，而對肺癌、宮頸癌的遷移和侵襲有促進(jìn)作用［9-12］。Chan等［13］研究發(fā)現(xiàn)，與正常卵巢上皮細(xì)胞相比，miR-378在卵巢癌細(xì)胞和腫瘤中表達(dá)量顯著增加，通過調(diào)控與血管生成、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲與遷移，可以作為卵巢癌中抗血管生成療法反應(yīng)的生物標(biāo)志物。miR-378在牛的卵泡發(fā)育過程中誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡，可能參與調(diào)控卵泡閉鎖［14］，且 miR-378 可以影響綿羊成肌細(xì)胞的增殖［15］。說明miR-378在哺乳動物生長發(fā)育過程中的調(diào)控功能具有多樣性和重要性。然而，miR-378在牦牛生長發(fā)育過程中的調(diào)控作用及功能尚不清楚。牦牛與普通牛種相比，牦牛生長速度慢、發(fā)情期晚、普遍繁殖性能低下，成為高原畜牧業(yè)發(fā)展及生態(tài)保護(hù)的主要瓶頸之一。

因此，本實(shí)驗(yàn)旨在克隆牦牛miR-378的前體序列，與其它物種的前體序列進(jìn)行同源性比對和進(jìn)化分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-378在不同組織中的表達(dá)特性，基于牦牛和牛屬近源物種，結(jié)合bta-miR-378-3p靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測和分析，探索miR-378在牦牛卵巢發(fā)育過程中的調(diào)控功能，旨為miR-378對牦牛繁殖性能的調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 普通PCR儀、CFX-96熒光定量PCR儀（Bio-Rad）、核酸/蛋白質(zhì)濃度測定儀（NANODROP2000）。

pMD18-T載體，PrimeScriptTMRT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自TaKaRa公司；Trizol、DNA提取試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞DH5α和膠回收試劑盒均購自天根生化科技有限公司；氯仿、異丙醇、75%乙醇（預(yù)冷）均購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇購自成都海興化工試劑廠。

1.1.2 樣品采集 選用西藏自治區(qū)昌都市類烏齊縣3頭4.5歲健康的類烏齊牦牛，屠宰后采集耳組織樣品其裝入凍存管，并分別卵巢、肝臟、乳腺、大腦、臀脂、臀大肌等組織，DEPC沖洗，錫箔紙包裝迅速置于液氮保存，帶回實(shí)驗(yàn)備用。

1.2 方法

1.2.1 牦牛miR-378前體序列克隆 按照DNA提取試劑盒說明書提取類烏齊牦牛耳樣的DNA，參照GenBank中 牛 pre-miRNA-378序 列（NC_037334），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR克隆引物（上游引物：5′ - AGGCTCCGAGAACCAG -3′；下游引物：5′ -TTACAGGAAGGACCAGACA -3′），用類烏齊牦牛耳樣的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段總長度為378 bp。PCR反應(yīng)總體系為：2×Dream Taq Green PCR Master Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上、下 游引物各 1 μL，最后加水至 25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性 4 min ；94℃ 變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min；然后取15 μL PCR產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，切膠回收DNA片段。將產(chǎn)物與pMD-19T載體連接并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，Amp+平板挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒后送英濰捷基（上海）生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2 miR-378序列保守性分析 利用blast將克隆得到的類烏齊牦牛miRNA-378前體序列與人（Homo sapiens，hsa）、小鼠（Mus musculus，mmu）、山羊（Capra hircus，chi）、豬（Sus scrofa，sus）、大猩猩（Gorilla gorilla，ggo）、牛（Bos taurus，bta）的前體序列進(jìn)行比對，分析其保守性。

1.2.3 牦牛miR-378組織表達(dá)譜

1.2.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)miRbase數(shù)據(jù)庫公布miRNA序列，采用莖環(huán)引物法設(shè)計(jì)miR-378-3p特異性莖環(huán)引物用于反轉(zhuǎn)錄和熒光定量表達(dá)引物，U6為內(nèi)參基因（參照張陽陽［16］），引物由英濰捷基（上海）生物技術(shù)有限公司合成，具體引物見表1。

表1 引物序列信息

1.2.3.2 Real-time-PCR 按照PrimeScriptTMRT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，由total RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系共10.0 μL，包含5 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、上下引物各0.4 μL（10 μmol/L）、1.0 μL cDNA 模板、3.2 μL R Nase-Free ddH2O。反應(yīng)條件：95℃變性30 s；95℃，5 s，60℃，30 s擴(kuò)增，39個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。Real-time PCR結(jié)果中miR-378-3p的相對表達(dá)量采用2-△△Ct公式計(jì)算，并用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，顯著性用One-Way ANOVA方差分析，進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以x-±s表示，P＜0.05為差異顯著。1.2.4 bta-miR-378-3p靶基因預(yù)測及生物學(xué)功能預(yù) 測 選 擇 TargetScan 7.1（http：//www.targetscan.org/vert_71/）、PicTar（https：//pictar.Mdc-berlin.de/）2個(gè)在線軟件預(yù)測bta-miR-378-3p靶基因，將兩者結(jié)果與 miRwalk 2.0（http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/index.html）上已驗(yàn)證的miR-378-3p靶基因結(jié)合作為深入分析的基因集合。將獲得靶基因集合導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行Gene Ontology聚類分析及KEGG信號通路富集分析，以所有蛋白編碼基因作為背景基因，GO條目與KEGG信號通路均通過Fsiher Exact Test計(jì)算P值，以P＜0.01為限制性閾值，分別得到相對于背景具有統(tǒng)計(jì)意義的高頻率注釋或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2 結(jié)果

2.1 牦牛pre-miR-378克隆及保守性分析

以類烏齊牦牛耳樣的DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增成功克隆了類烏齊牦牛pre-miRNA-378序列，擴(kuò)增片段總長度為378 bp（圖1），其中135-200 bp為pre-miRNA-378序列，長為66 bp。

圖1 牦牛miR-378前體PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

將其序列與人、小鼠、牛等6個(gè)物種的premiRNA-378及種子序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果如表2所示，各物種間序列相似性很高，且各個(gè)物種之間miR-378-3p種子序列（CUGGACU）完全一致，說明miRNA-378序列有很高的保守性。

2.2 miR-378-3p在牦牛不同組織表達(dá)差異

通過Real-time PCR方法檢測miR-378-3p在牦牛卵巢、乳腺、臀大肌、大腦、臀脂和肝臟中的相對表達(dá)量，結(jié)果（圖2）顯示miR-378-3p在各組織中均存在表達(dá)，且在臀大肌中表達(dá)水平最高，顯著高于其他組織（P＜0.01），在臀脂中的表達(dá)高于卵巢、大腦、乳腺和肝臟，在卵巢中表達(dá)水平最低。

2.3 bta-miR-378-3p靶基因預(yù)測及生物學(xué)功能預(yù)測

選擇TargetScan和PicTar 2種計(jì)算方法預(yù)測btamiR-378-3p的靶基因，合并已經(jīng)證實(shí)為miR-378-3p的18個(gè)來自miRwalk數(shù)據(jù)庫的靶基因，獲得共計(jì)316個(gè)靶基因作為后續(xù)GO和KEGG pathway分析的靶基因集合。其中272個(gè)基因具有GO分子注釋信息，結(jié)果（表3-表6）顯示bta-miR-378-3p的靶基因富集于細(xì)胞分化、細(xì)胞發(fā)育、大分子代謝及神經(jīng)元分化等多個(gè)生物學(xué)過程中，具有與特異DNA序列結(jié)合及轉(zhuǎn)錄調(diào)控活動的分子作用。

在GO注釋分類的基礎(chǔ)上，利用已有生物通路數(shù)據(jù)對基因集合中的272個(gè)基因進(jìn)行生物通路富集分析。結(jié)果（圖3）顯示，bta-miR-378-3p預(yù)測靶基因主要參與孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）信號通路（圖4）、長期抑郁癥、癌癥途徑、Rap1信號通路等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

表2 牦牛與不同物種miR-378前體序列的比對結(jié)果

圖2 牦牛miR-378-3p在不同組織中的相對表達(dá)量

圖3是孕酮介導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的信號通路，在第一次減數(shù)分裂前期自然停滯的卵母細(xì)胞在孕酮誘導(dǎo)下停滯被破壞，卵母細(xì)胞恢復(fù)兩個(gè)減數(shù)分裂周期并發(fā)育成熟為可受精的卵子，此過程中胰島素、IGF1（胰島素樣生長因子1）、MAPK（絲裂原激活蛋白激酶）、孕酮是主要的誘因。

圖4為下丘腦分泌的GnRH（促性腺激素釋放激素）調(diào)節(jié)垂體產(chǎn)生和釋放促性腺激素的通路圖，此過程伴隨MAPK的激活。

3 討論

目前，miRbase（http：//www.mirbase.org/）數(shù)據(jù)庫收錄的 miRNA條目已達(dá)38 589條，數(shù)以萬計(jì)的miRNA在人體各類細(xì)胞中發(fā)揮作用，同一miRNA靶向不同的基因促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖分化，因此，僅僅靠實(shí)驗(yàn)手段來研究miRNA已變得相當(dāng)困難。靶基因數(shù)量和種類較多，生物信息學(xué)軟件的應(yīng)用在miRNA的研究中必不可缺，TargetScan和 PicTar作為第二代預(yù)測算法，Target Scan首次引入假陽性率來評價(jià)靶基因預(yù)測結(jié)果，要求miRNA種子序列（第2到第8位核苷酸）和mRNA 3′UTR完全互補(bǔ)，該軟件的輸入要求是2個(gè)以上物種 UTR 比對后的序列作為輸入，由于其要求種子序列完全互補(bǔ)，隨著物種數(shù)目的增多，其預(yù)測靶基因的數(shù)量相對減少，但和實(shí)驗(yàn)證實(shí)的靶基因集合吻合率相應(yīng)增高。所不同的是PicTar把種子序列分為“完全匹配的種子序列”和“不完全匹配的種子序列”分別進(jìn)行篩選，PicTar亦結(jié)合以前實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對兩類種子序列對應(yīng)的 miRNA和靶基因二聚體結(jié)合能進(jìn)行了限制，有效降低假陽性率［17］。且TargetScan數(shù)據(jù)庫中包含?；?，綜合miRwalk 數(shù)據(jù)庫（2014）中已驗(yàn)證靶標(biāo)作為靶基因集合進(jìn)行后續(xù)分析，減少假陽性率，靶基因預(yù)測軟件基于miRNA種子序列與靶基因的3′-UTR進(jìn)行配對，bta-miR-378-3p種子序列在各物種高度保守，從而保證了后續(xù)功能分析的全面和可靠性。

表3 miR-378-3p靶基因參與的生物學(xué)過程（前20個(gè)）

表4 miR-378-3p靶基因參與的細(xì)胞組成分類

表5 miR-378-3p靶基因參與分子功能分類

表6 miR-378-3p靶基因參與的KEGG通路富集分析

圖3 孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟信號通路

目前研究已證實(shí)miR-378 在脂肪分化［18］、肌細(xì)胞增殖分化［15］、卵巢發(fā)育［14］、癌癥發(fā)生［13］等生物過程中都有重要的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)成功克隆牦牛pre-miRNA-378序列，與其它物種的前體序列進(jìn)行同源性比對顯示序列保守性較高，且牦牛與牛的pre-miR-378序列完全一致，牛是牦牛的近源物種，表明牛該miRNA的研究可為探究牦牛miR-378的調(diào)控方式提供參考。

為了進(jìn)一步研究該基因?qū)︻悶觚R牦牛的調(diào)控功能，本實(shí)驗(yàn)利用qPCR方法檢測了miR-378-3p在類烏齊牦牛的6個(gè)組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，miR-378-3p在臀大肌和臀脂中表達(dá)水平較高，在臀大肌中表達(dá)水平極顯著高于其他組織，推測其在類烏齊牦牛肌肉和脂肪中存在重要調(diào)控作用。miR-378-3p 靶基因GO分析結(jié)果顯示其與細(xì)胞分化、發(fā)育、大分子代謝等多個(gè)生物學(xué)過程相關(guān)，已有研究證實(shí)在牛骨骼肌發(fā)育中，miR-378具有抑制牛肌細(xì)胞增殖而促進(jìn)其分化的作用［19］，達(dá)到促進(jìn)肌管形成的效果［4］，牦牛體格健壯，肌肉組織極其發(fā)達(dá)可能與miR-378促進(jìn)肌細(xì)胞分化機(jī)制有密切聯(lián)系。過表達(dá)miR-378a-3p可以抑制MAPK1（絲裂原活化蛋白激酶1）的表達(dá)從而促進(jìn)牛脂肪形成［20-21］，推測miR-378與牦牛肌纖維和脂肪形成有密切關(guān)系，從而對牦牛肉質(zhì)性狀和脂肪沉積產(chǎn)生影響。

圖4 GnRH信號通路

雌二醇是一種類固醇激素，不僅在卵巢卵泡發(fā)育中起重要作用，而且與許多生殖功能紊亂有關(guān)，Xu 等［22］研究發(fā)現(xiàn)豬卵泡顆粒細(xì)胞中miR-378靶向結(jié)合芳香化酶3’UTR，降低芳香化酶蛋白表達(dá)和雌二醇釋放。在顆粒細(xì)胞中miRNA-378-3p通過靶向PGR（孕酮受體）降低其蛋白質(zhì)水平和mRNA水平［23］。綜合以上研究，表明miR-378對黃體發(fā)育、孕激素（孕酮等）和雌激素分泌（雌二醇等）有抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)中KEGG信號通路分析bta-miR-378-3p靶基因主要參與孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟信號通路、促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）信號通路、長期抑郁癥、癌癥途徑、Ras相關(guān)蛋白1（Ras-proximate-1，Rap1）信號通路。其中孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟信號通路、GnRH信號通路在卵巢發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟中發(fā)揮重要功能，IGF1、MAPK1、PGR是主要的靶基因。

然而miR-378-3p在本實(shí)驗(yàn)牦牛卵巢樣品中相對表達(dá)量最低，可能由于miRNA表達(dá)在實(shí)驗(yàn)樣品中呈現(xiàn)出時(shí)序特異性，牛黃體不同發(fā)育期miR-378有明顯表達(dá)差異［24］：在黃體形成時(shí)miR-378的表達(dá)量增加到正常水平的5倍，而在黃體退化階段，表達(dá)量迅速下降，豬大卵泡顆粒細(xì)胞的miR-378表達(dá)量顯著低于小卵泡顆粒細(xì)胞，表明miR-378在哺乳動物卵巢發(fā)育過程中具有一定的調(diào)控作用，在母豬正常發(fā)情時(shí)卵巢miR-378表達(dá)量顯著低于不發(fā)情時(shí)期［25］，已有研究證實(shí)，miRNA參與調(diào)節(jié)牦牛卵巢發(fā)育過程［26］，且miR-378在各物種間高度保守，實(shí)驗(yàn)樣品中3頭類烏齊牦牛正處于發(fā)情期，卵泡發(fā)育正常，故卵巢miR-378呈現(xiàn)低表達(dá)。根據(jù)bta-miR-378-3p功能預(yù)測結(jié)果繼續(xù)分析，為進(jìn)一步探索牦牛miR-378在卵巢組織的表達(dá)規(guī)律奠定理論基礎(chǔ)。

IGFs（胰島素樣生長因子）可啟動卵裂，增加致密化和胚泡形成率，是胚胎發(fā)育和代謝的重要調(diào)節(jié)因子之一。IGF1通過調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?09（HSP70）抑制牦牛卵丘細(xì)胞凋亡［27］，李莉華等［28］研究miR-378對肝癌細(xì)胞生長增殖的影響機(jī)制證實(shí)miR-378通過降低靶基因IGF1R（胰島素樣生長因子1類受體）的表達(dá)發(fā)揮抑制作用。miR-378通過下調(diào)MAPK1抑制前列腺癌細(xì)胞生長［2］。根據(jù)下丘腦-垂體-卵巢軸系統(tǒng)：下丘腦通過分泌GnRH調(diào)節(jié)垂體促性腺激素的釋放，從而控制卵巢發(fā)育和性激素（孕酮、雌二醇）的分泌，同時(shí)，孕酮和雌二醇對下丘腦和垂體具有反饋調(diào)節(jié)作用。綜合以上研究結(jié)果推測miR-378-3p可能通過降低靶基因IGF1、MAPK1、PGR的表達(dá)負(fù)調(diào)控牦牛的下丘腦-垂體-卵巢軸系統(tǒng)，抑制卵巢發(fā)育和性激素（孕酮、雌二醇）的分泌等生物過程，負(fù)面影響母牦牛發(fā)情、求偶和接受交配、妊娠，進(jìn)而降低了母牦牛的繁殖性能。

本實(shí)驗(yàn)為了探索miR-378在牦牛生長發(fā)育中的調(diào)控作用，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-378-3p在各組織之間表達(dá)規(guī)律，結(jié)合生物信息學(xué)軟件基于btamiR-378-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測和功能分析?？傊?，本實(shí)驗(yàn)成功克隆牦牛pre-miRNA-378序列，與其它物種的前體序列比對顯示序列保守性較高，miR-378-3p在牦牛各組織中均存在表達(dá)，且在臀大肌中表達(dá)水平最高，在臀脂中的表達(dá)高于大腦、乳腺和肝臟，推測miR-378-3p對牦牛肌肉、脂肪形成具有一定調(diào)控作用，挖掘出IGF1、MAPK1、PGR等關(guān)鍵靶基因以及孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟信號通路、GnRH信號通路等重要信號通路。本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果為研究miR-378在牦牛中的作用提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步闡明其作用及分子機(jī)制仍需繼續(xù)進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功克隆了pre-miR-378，其與牛、小鼠和山羊pre-miR-378相似性較高，人和大猩猩次之，豬最低。生物信息學(xué)分析表明，miR-378-3p可能通過抑制孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟信號通路、GnRH信號通路中靶基因IGF1、MAPK1、PGR等的表達(dá)調(diào)控卵泡的發(fā)育、排卵及卵母細(xì)胞成熟過程，進(jìn)而影響母牦牛的繁殖性能，熒光定量PCR檢測miR-378在牦牛臀大肌和臀脂中表達(dá)水平最高，說明miR-378還參與牦牛肌纖維和脂肪形成。