棉花GhDMT3的功能驗證及生物信息學(xué)分析

楊笑敏 王俊娟 王德龍 陸許可 陳修貴 郭麗雪 王帥 陳超王曉歌 韓明格 葉武威

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所 棉花生物學(xué)國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)部棉花遺傳改良重點開放實驗室，安陽 455000）

S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下把甲基（-CH3）轉(zhuǎn)移到DNA分子中特定堿基上的過程稱為DNA甲基化的過程［1］。多數(shù)發(fā)生在CpG島的胞嘧啶第5位碳原子（C5）上，通常發(fā)生在對稱序列CG中，但是在CHG和CHH（H=A、C或T）序列中也有發(fā)生［2］。DNA甲基化是一種廣泛存在的表觀遺傳過程，包括轉(zhuǎn)座子的抑制、基因組印記［3］、X染色體失活［4］、細胞分化［5］和胚胎發(fā)育［6］。在脅迫條件下植物通過DNA甲基化過程，誘導(dǎo)一些與抗逆相關(guān)的基因表達，增強植物的抗逆性，維持植物的生長發(fā)育和進化過程［7］。DNA甲基化是一種植物響應(yīng)逆境脅迫的分子機制［8］。植物中存在2種DNA甲基化方式：一種是維持甲基化（Maintenance methylation），通過半保留復(fù)制把雙鏈DNA分子的一條鏈存在甲基化，另一條鏈沒被甲基化的親代甲基化模式傳遞給子代［9］；另一種是從頭甲基化（De novomethylation），通過不同的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化將不存在甲基化的DNA雙鏈形成甲基化［10］。植物中的C5-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有4種，維持DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Methyltransferase，MET）家族［11］；染色質(zhì)甲基化酶（Chromomethylase，CMT）家族［12］；Dnmt2；結(jié)構(gòu)域重排甲基轉(zhuǎn)移酶（Domains rearranged methyltransferase，DRM）家族可以在RNA指導(dǎo)下，催化胞嘧啶從頭甲基化，以及維持非CpG位點的甲基化［13］；MET、CMT與動物的DNMT1 為同源［14］；DRM 與動物的 DNMT3 同源［15］。

非生物脅迫嚴重影響和制約著農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。當煙草發(fā)生滲透脅迫時（NicotianaL.）組織培養(yǎng)細胞的異染色質(zhì)區(qū)會發(fā)生DNA超甲基化［16］。CHROMOMETHYLASE3（SLCMT3）基因可以使Chr番茄果實的成熟，提高控制成熟關(guān)鍵基因的表達［17］；當蘿卜（Raphanus sativusL.）受到重金屬鉻脅迫時DNA的甲基化水平會升高［18］；玉米（Zea maysL.）受到冷脅迫時，根系通過降低核小體中心DNA甲基化水平誘導(dǎo)ZmMI1表達，受到鹽脅迫時玉米幼苗zmPP2C甲基化將下調(diào)和zmGST表達量也下調(diào)［19］；大豆受干旱、冷、鹽脅迫時，根中CaDRM1和CaDRM2的表達量上調(diào)，以應(yīng)對脅迫壓力［20］；苜蓿種子發(fā)育和結(jié)瘤的早期階段MtDRM1和MtDRM2高度表達，MtDRM3在種子和結(jié)節(jié)發(fā)育階段表達量高［20］。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與抗逆性密切相關(guān)，深入對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用機制進行研究，對進一步挖掘抗逆基因具有重要意義。

棉花作為重要的經(jīng)濟作物，其棉纖維可以制作成織物，棉籽可以榨油，在人們的日常生活中應(yīng)用廣泛。脅迫條件下，棉花產(chǎn)量會大幅度減產(chǎn)；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶可以增強植物的耐受性，GhDMT3是DRM家族的一員，在水稻中鑒定出2個DRM家族相關(guān)基因、苜蓿中鑒定出4個DRM家族的成員、在大豆中發(fā)現(xiàn)5個DRM家族相關(guān)基因、在玉米和擬南芥中各含有2個DRM家族的成員，而棉花中的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶研究較少。本研究通過對棉花GhDMT3進行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建pYL156：GhDMT3沉默載體，對其進行功能驗證，為提高棉花抗逆性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

陸地棉TM-1由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所品種資源研究室保存。所用菌種為大腸桿菌E.coliDH5α，農(nóng)桿菌 LB3101、pYL156、pYL192（輔助載體）和pYL156：GhDMT3（陽性對照載體）載體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所基因組測序課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的制備 按照北京艾德萊生物科技的RN38 EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒說明書提取RNA，按照北京全式金的TransScript ΙΙ All-in -One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal） 說明書制備cDNA。

1.2.2GhDMT3的克隆 用Primer Premier 5軟件設(shè)計GhDMT3引物（F：ATGGTTGACAATAATTCGGGTGG；R：TCAGATAATCATTGATTTTGTG），以cDNA為模板進行擴增，PCR程序為94℃ 5 min；94℃20 s，54℃ 20 s，72℃ 70s，34 個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收、純化，與T載連接，并轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性單克隆并測序，獲得正確的t-GhDMT3序列。

1.2.3 構(gòu)建pYL156：GhDMT3的VIGS載體 用EcoRⅠ和XmaⅠ雙酶切PYL156，獲得線性pYL156載體，以克隆載體t-GhDMT3為模板用引物in-VGhDMT3進行擴增，獲得VIGS片段。用in-FuSion技術(shù)將GhDMT3的VIGS沉默片段插入到線性的PYL156載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，挑取陽性單克隆測序，獲得正確的單克隆，并用EcoRⅠ和XmaⅠ雙酶切驗證，成功構(gòu)建pYL156：GhDMT3載體。

1.2.4 pYL156：GhDMT3的VIGS沉默及表達量檢測 種植TM-1到兩片子葉平展時，用一次性的醫(yī)用注射器在葉片的背面，進行VIGS注射，注射面積在75%以上。然后置于25℃黑暗培養(yǎng)24 h，處理結(jié)束后，在適宜的溫度（28℃ 14 h/25℃ 10 h）下保證幼苗正常生長。當出現(xiàn)白化后，對植株分別進行冷（4℃）和干旱（自然干旱）處理，當與對照出現(xiàn)表型差異時，測定GhDMT3的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 GhDMT3蛋白的理化性質(zhì)及親水性/疏水性分析

通過ExPASY網(wǎng)站的生物軟件ProtParam程序?qū)hDMT3編碼的蛋白進行組分分析，該蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為71 107.02 kD，等電點為4.85，該基因編碼的蛋白質(zhì)分子式為C3151H4897N849O981S23，共計9 901個原子，編碼640個氨基酸，其中65個帶正電的氨基酸（Arg +Lys），96個帶負電的氨基酸（Asp+Glu），不穩(wěn)定系數(shù)為36.33，脂肪系數(shù)為81.81，總平均親水性為-0.364，預(yù)測該蛋白為酸性蛋白，不含有賴氨酸和絲氨酸，色氨酸含量最低為1.6%，亮氨酸含量最高為10.2%。

2.2 GhDMT3蛋白質(zhì)的親疏水性分析

圖1 GhDMT3蛋白的疏水性/親水性檢測

利用ProtScale網(wǎng)站對GhDMT3蛋白的親疏水性進行預(yù)測，結(jié)果（圖1）表明，在256位的S親水性最強分值為-2.357，在517位的F疏水性最強分值為1.210，親水性總平均值為-1.157，推測該基因的整個氨基酸序列中親水性氨基酸比疏水性氨基酸多，所以該蛋白為親水性蛋白。綜上所述，該基因編碼的蛋白具有一定的親水能力但不穩(wěn)定。

2.3 GhDMT3蛋白的跨膜分析

通過TMHMM網(wǎng)站對GhDMT3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進行分析（圖2），GhDMT3蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白，與該蛋白的疏水性區(qū)域分析結(jié)果基本一致。利用SignalP-4.0網(wǎng)站對GhDMT3蛋白的信號肽預(yù)測結(jié)果為C值（剪切位點）為0.114，S值（信號肽）為0.109，Y值（綜合剪切點）為0.105（圖3）。GhDMT3蛋白并不是分泌型蛋白，不在細胞中發(fā)生遷移。

圖2 GhDMT3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析

圖3 GhDMT3蛋白的信號肽預(yù)測

2.4 GhDMT3蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析

圖4 GhDMT3基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)

通過軟件預(yù)測分析GhDMT3蛋白的二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果（圖4）表明，無規(guī)則卷曲包含298個氨基酸殘基，占46.56%，α螺旋包含266個氨基酸殘基，占41.11%，延伸鏈包含67個氨基酸殘基，占10.47%，β-轉(zhuǎn)角包含33個氨基酸，占5.12%。

2.5 GhDMT3蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析

使用軟件SWISS-MODEL預(yù)測GhDMT3蛋白的三維結(jié)構(gòu)，GhDMT3蛋白三維結(jié)構(gòu)以α螺旋為主（圖5），符合GhDMT3蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析。

圖5 GhDMT3蛋白的三級結(jié)構(gòu)

2.6 構(gòu)建GhDMT3的VIGS載體

利用RT-PCR技術(shù)擴增GhDMT3，轉(zhuǎn)T載體，獲得t-GhDMT3；以克隆載體t-GhDMT3為模板，對in-v-GhDMT3進行擴增，獲得VIGS片段（圖6-A）。用in-FuSion技術(shù)將GhDMT3的VIGS沉默片段插入到pYL156載體上，并用EcoRⅠ和XmaⅠ雙酶切驗證（圖6-B），即成功構(gòu)建pYL156：GhDMT3載體。

2.7 VIGS侵染后棉花的表型和GhDMT3的表達量分析

圖6 VIGS載體pYL156：GhDMT3的構(gòu)建與驗證

VIGS侵染棉花植株15 d左右，陽性植株葉片白化明顯，其他正常生長，用沒有侵染的棉花和用pYL156侵染的棉花作對照，對沉默植株進行冷、干旱的脅迫處理。冷處理36 h后植株表型差異明顯（圖7-A），注射pYL156的植株與野生型的新生真葉枯萎卷曲，注射pYL156：GhDMT3的植株正常生長，表型變化不明顯。pYL156侵染的棉花中在不同脅迫下表達量無顯著變化，與對照相比，用pYL156：GhDMT3侵染過的棉花GhDMT3轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。根部下降最多；莖部次之；葉片下降最少（圖7-B）。

自然干旱6 d后植株表型差異明顯，注射pYL156的植株和野生型的子葉脫落，新生真葉發(fā)黃枯萎，嚴重失水，植株死亡，注射pYL156：GhDMT3的植株真葉沒有枯萎失水現(xiàn)象（圖8-A）。檢測pYL156：GhDMT3侵染過的棉花中GhDMT3的相對表達量，由圖可知pYL156侵染的棉花中在不同脅迫下表達量沒有變化，用pYL156：GhDMT3侵染過的棉花中GhDMT3轉(zhuǎn)錄水平與對照相比葉片中下降最多；莖部次之；根部下降最少（圖8-B）。

圖7 VIGS侵染后的棉花表型和冷脅迫36 h的棉花表型（A）；VIGS侵染成功冷脅迫處理后植株的相對表達量（B）

圖8 VIGS侵染后的表型和干旱脅迫6 d的表型（A）及VIGS侵染成功干旱脅迫處理后植株的相對表達量（B）

3 討論

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是DNA甲基化過程中的關(guān)鍵酶，在擬南芥［10］、水稻［21］、玉米［22］、大豆［20］、葡萄［23］、番茄［24］及蓖麻［25］等植物中鑒定出 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶。GhDMT3與蓖麻中的DRM家族基因編碼蛋白一致，該家族基因編碼蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白，不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲、α螺旋為主為。通過分析GhDMT3三維結(jié)構(gòu)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的典型結(jié)構(gòu)類似，但是有一定的區(qū)別，具體原因需要后續(xù)實驗探明。

大豆的DRM基因在非生物脅迫期間轉(zhuǎn)錄水平較高參與誘導(dǎo)DNA甲基化改變［20］，當擬南芥drm1和drm2雙突變時會造成所有已知模式的胞嘧啶從頭甲基化均有缺失［10］，DRM家族基因?qū)τ贔WA和SUP的基因沉默是重要的，可以通過不同的機制使直接重復(fù)和反向重復(fù)發(fā)生甲基化［26］。通過沉默GhDMT3基因，證明該基因與抗逆性相關(guān)，為明確該基因的功能奠定基礎(chǔ)，而該基因的具體功能需要進一步研究。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建了GhDMT3的VIGS沉默載體，獲得轉(zhuǎn)基因植株，在冷、干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株抵抗力增強。