不同胡麻品種TAG合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)與含油量、脂肪酸組分的相關(guān)性分析

李聞娟，齊燕妮，王利民，黨照，趙利， 趙瑋，謝亞萍，王斌，張建平*，李淑潔

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070)

胡麻(Linumusitatissimum)是一年生的二倍體自花授粉植物，屬于亞麻科亞麻屬[1]。胡麻是全球非常重要的油料作物，主要種植于印度，加拿大和中國[2]。胡麻籽一般含有40%～50%的油脂[3]，被用來作為食品原料有很高的營養(yǎng)價值。胡麻籽中含有多種脂肪酸，主要由棕櫚酸(palmitic acid，PAL，C16∶0，約6%)、硬脂酸(stearic acid，STE，C18∶0，約4.4%)、油酸(oleic acid，OLE，C18∶1，約24.2%)、亞油酸(linoleic acid，LIO，C18∶2，約15.3%)和亞麻酸(linolenic acid，LIN，C18∶3，約50.1%)組成[4]，其中大約有73%的脂肪酸是多不飽和脂肪酸，而α-亞麻酸(α-linolenic acid，ALA，C18∶3)大約占了50%[5]。胡麻油是含有α-亞麻酸最豐富的農(nóng)產(chǎn)品，很多研究表明亞麻酸對人的身體健康有很多的益處，它能夠預(yù)防心血管疾病、高血壓和癌癥[6-8]。近年來，由于胡麻種子含有豐富的亞麻酸，已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于營養(yǎng)食品的加工。

在很多植物中，種子中的油脂主要以三酰甘油(TAG，triacylglycerol)的形式儲存，作為種子中碳和能量的來源。在種子里，TAG在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，積聚在油體中[9]。TAG的合成有兩條途徑，一條是依賴于脂酰-CoA的途徑。首先，脂酰-CoA通過甘油-3-三磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT，glycerol-3-phosphate acyltransferase)對sn-1的位置?；?，GPAT是這條途徑中的限速酶[10]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中過表達(dá)GPAT基因可以增加種子的含油率和種子重量[11]。在擬南芥中，GPATs家族有10多個同源基因，只有GPAT9 (At5g60620)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，參與TAG生物合成時甘油碳鏈骨架sn-1位置的酰基化反應(yīng)[12-13]。最后通過二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT, acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase)的催化在sn-3位置?；a(chǎn)生TAG。DGAT也被認(rèn)為是植物中油脂儲存的限速酶[14-16]。在不同的植物種類中，DGATs酶的類型也不同。在大部分生物中，DGAT1和DGAT2是TAG合成途徑中的兩種重要酶，它們定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不同的區(qū)域，在TAG的合成中有不同的功能[17-18]。DGAT1在許多油料種子中對TAG的積聚和脂肪酸的組分有非常重要的影響[19]，DGAT2主要在很多特殊脂肪酸含量較高的植物中對油脂的積聚和組分有很重要的影響。在這些植物種子中，DGAT2的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DGAT1[20-22]。另一條是不依賴于脂酰-CoA的途徑[23]，TAG還可以被不依賴于脂酰-CoA的磷脂酰膽堿：二?；视王；D(zhuǎn)移酶(PDAT，phospholipid: diacylglycerol acyltransferase)催化合成，從磷脂的sn-2轉(zhuǎn)移?；?sn-1,2-甘油二脂(DAG, diacylglycerol)的sn-3位置[24-25]。從擬南芥中分離出兩個同源的PDAT基因，PDAT1(At5g13640)和PDAT2(At3g4480)。PDAT1是TAG的生物合成中主要的酶之一[26]。在油桐(Verniciafordii)[24]和蓖麻(Ricinuscommunis)[21]中，發(fā)現(xiàn)DGAT1、DGAT2和PDAT對TAG的合成有重要的作用，特別是DGAT2和PDAT在這些種子里有很高的表達(dá)，這兩種酶可能參與油脂中特殊脂肪酸的生成[22]。

在植物中影響多不飽和脂肪酸的合成還有兩個關(guān)鍵酶—脂肪酸去飽和酶FAD2和FAD3，生成亞油酸和亞麻酸。FAD2被認(rèn)為是脂肪酸合成通路的限速酶[27]，是油酸脫氫形成亞油酸的關(guān)鍵酶[28]。FAD3是亞油酸去飽和生成亞麻酸的關(guān)鍵酶[29]。在啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表達(dá)擬南芥的FAD2基因能使亞油酸含量增高[30]。Yadav等[31]報道了擬南芥FAD3的突變體與野生型相比亞麻酸含量降低了3%。

本研究以含油量和亞麻酸含量有顯著差異的3個胡麻品種(系)為材料，分析了張亞2號、R2-17和隴亞10號中油脂和脂肪酸組分的動態(tài)積累模式，以及在不同發(fā)育階段的不同組織中TAG合成途徑中7個關(guān)鍵基因 (GPAT9、DGAT1 &DGAT2、PDAT1 &PDAT2、FAD2A&FAD3A) 的動態(tài)表達(dá)模式及相關(guān)性，以期篩選鑒定出與胡麻含油量及脂肪酸組分顯著相關(guān)的基因，為進(jìn)一步通過分子育種培育高油、高亞麻酸含量胡麻新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

3個胡麻品種張亞2號、R2-17和隴亞10號作為試驗材料(由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所胡麻課題組提供)，于2017年3月種植于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州實驗基地(36° N，103°40′ E，海拔1500 m)。每個材料種植50行，行長2 m，行距0.2 m，每行200株，按照常規(guī)種植管理方式進(jìn)行田間管理。在花開時標(biāo)記花，花開2～3朵時作為開花初期，從開花初期到開花后10、20、30、40和 50 d收集不同階段的根、莖、葉(50 d時葉已凋落，未取50 d的葉)、花和種子(圖1)，所有材料用無菌剪刀和鑷子完整的分離開，每份樣品至少取15株混合。所有的樣品從田間取樣并用蒸餾水沖洗干凈，各個組織用液氮速凍并于-80 ℃保存?zhèn)溆?。不同發(fā)育階段的種子于75 ℃的烘箱中烘干至恒重。

圖1 3個胡麻品種開花后不同發(fā)育階段的種子Fig.1 Seeds of three linseed varieties in five seed developmental stages A：張亞2號開花后10～50 d的烘干種子；B：隴亞10號開花后10～50 d的烘干種子；C： R2-17開花后10～50 d的烘干種子；D：隴亞10號開花后10～50 d的新鮮種子。標(biāo)尺=10 mm.A: Dried seeds in 10th-50th day after flowering of Zhangya 2; B: Dried seeds in 10th-50th day after flowering of Longya 10; C: Dried seeds in 10th-50th day after flowering of R2-17; D: Fresh seeds in 10th-50th day after flowering of Longya 10. Scale bars=10 mm.

1.2 RNA的提取及cDNA第一條鏈合成

總RNA參考RNA提取試劑盒(Qiagen)說明書提取。用Nanodrop 2000測定RNA的濃度和質(zhì)量，樣品的260/280 nm為1.8～2.0。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，沒有降解。用Prime-Script II試劑盒(TaKaRa)合成cDNA第一條鏈。每個不同發(fā)育階段的cDNA樣品儲存于-20 ℃。所有標(biāo)準(zhǔn)樣和有機(jī)溶劑采購于Introvigen或Takara公司。

1.3 引物合成

胡麻GPAT9基因序列由本實驗室測序比對得到，熒光定量引物用Primer 5.0設(shè)計。PDAT1/PDAT2、DGAT1/DGAT2、FAD2A/FAD3A從已經(jīng)報道過的引物中選取[10,28]。甘油醛-3-磷酸(GAPDH，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)用做內(nèi)參基因[2]。所有引物由上海生物化工公司合成(表1)。熒光定量的引物用Premix Ex Taq DNA polymerase試劑盒 (TaKaRa)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增基因片段檢測。擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 3 min；然后 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，擴(kuò)增32個循環(huán)；72 ℃ 后延伸5 min。PCR產(chǎn)物用GelRed染料染色，通過1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for real time-PCR analysis

1.4 實時熒光定量PCR

采用Eco(illumina公司)熒光定量PCR儀，2×SYBR熒光定量試劑盒(Biomiga)。每50 μL的體系里包含100 ng·μL-1cDNA模板2 μL，SYBR染料25 μL，上下游引物各1 μL (10 μmol·L-1)，ddH2O 21 μL。擴(kuò)增條件如下：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。每個反應(yīng)繪制融解曲線，為了確保擴(kuò)增的特異性。每份樣品重復(fù)3次，用GAPDH作為內(nèi)參，由2-ΔΔCt方法計算得出[32]。

1.5 油脂和脂肪酸的測定

用Soxtec 8000(FOSS公司)提取油脂，方法遵照儀器說明書。脂肪酸的分析使用脂肪酸甲酯化方法[33]。用安捷倫7820A氣相色譜儀分析脂肪酸組分，使用30 m×0.32 mm×0.33 μm的AT.KD-FFAP柱子。每個樣品重復(fù)3次(測定脂肪含量采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14772-2008；測定脂肪酸組分采用氣相色譜法)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、單因素方差分析及顯著性差異比較，用Excel 2010進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡麻發(fā)育階段油脂的積累規(guī)律

試驗結(jié)果表明，3個參試品種(系)張亞2號、R2-17和隴亞10號的含油量和脂肪酸組分存在極顯著的差異(P≤0.01)。張亞2號成熟種子的含油量最高，R2-17的最低，隴亞10號居中(表2)。

表2 3個品種(系)在種子成熟期時的含油量和5種脂肪酸組分Table 2 Oil content and average contents of five FAs in three flax varieties (%)

注：同列不同小寫字母表示差異顯著，采用Duncan’s 多重比較法分析 (P≤0.01,n=3)。

Note: Duncan’s multiple range test, different small letters in the same column indicate significant difference (P≤0.01,n=3).

種子不同發(fā)育階段含油量的積累動態(tài)表明，不同品種開花后10～20 d，種子油脂快速積累，種子含油量大約增加了30%，張亞2號的油脂積累速率明顯高于R2-17和隴亞10號。開花后20 d到成熟期，油脂的積累速率變化不大，但是不同品種存在明顯差異。張亞2號的油脂積累速率一直呈現(xiàn)增加趨勢，而隴亞10號油脂積累速率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，含油量較低的R2-17油脂積累速率呈現(xiàn)下降趨勢(圖2A)。

2.2 種子發(fā)育階段脂肪酸組分的變化

胡麻的5種主要脂肪酸組分結(jié)果見圖1B～F。在3個品種(系)中，硬脂酸和油酸的積累規(guī)律不同(圖2C, D)。棕櫚酸、亞油酸和亞麻酸的積累規(guī)律相似(圖2B,E,F)。棕櫚酸隨著種子的發(fā)育含量逐漸減少，開花后20 d下降較明顯(圖2B)。亞油酸從開花后10～20 d下降較明顯，之后R2-17中的亞油酸含量變化幅度不大，張亞2號中的亞油酸含量從開花后40～50 d下降較明顯，隴亞10號中的亞油酸含量持續(xù)下降直至種子成熟。成熟期亞油酸的含量與發(fā)育早期存在差異(圖2E)，且成熟期時，張亞2號的亞油酸含量最低。亞麻酸是胡麻油中最重要的脂肪酸，從胡麻開花后10～20 d含量增高較明顯，且張亞2號和R2-17的亞麻酸增長趨勢高于隴亞10號。在張亞2號中，亞麻酸含量隨著種子發(fā)育階段持續(xù)增高直至種子成熟。在R2-17中，亞麻酸含量隨著種子發(fā)育緩慢下降。在隴亞10號中，亞麻酸含量從開花后20～40 d含量緩慢增高，到成熟期時略有下降，成熟期時，張亞2號的亞麻酸含量最高，R2-17次之，隴亞10號最低(圖2F)。

圖2 3個胡麻品種在種子發(fā)育階段的含油量和脂肪酸組分的積累模式Fig.2 Changes in total oil content and fatty acid profiles of three flax varieties in five seed developmental stages A：3個胡麻品種種子發(fā)育階段中含油量的積累模式；B～F：種子發(fā)育階段中5種脂肪酸[棕櫚酸(PAL)，硬脂酸(STE)，油酸(OLE)，亞油酸(LIO)，亞麻酸(LIN)]的積累模式。圖中不同小寫字母表示差異顯著 (P≤0.05, n=3)。A: Total oil content in developing seeds of three flax varieties; B-F: Five fatty acids [palmitic (PAL), stearic (STE), oleic (OLE), linoleic (LIO) and linolenic (LIN)] were analyzed from five seed developmental stages of three flax varieties. Different lowercases indicate significant difference (P≤0.05, n=3).

2.3 胡麻各個組織的不同發(fā)育階段與油脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析

胡麻不同組織中的不同發(fā)育階段與TAG合成和脂肪酸去飽和相關(guān)的7個酶基因的瞬時表達(dá)分析結(jié)果見圖3～9。

2.3.1GPAT9基因表達(dá)分析GPAT9基因在胡麻的根、莖、葉、花和種子中均有表達(dá)，主要在發(fā)育后期的莖和發(fā)育早期的葉中表達(dá)最高，發(fā)育中期的根和種子中次之。在根中的表達(dá)量是先增高后降低；在莖中表達(dá)量逐漸增高；在葉中表達(dá)量逐漸降低。在種子中，3個材料中GPAT9的表達(dá)都是先增高后降低。開花后20 d時表達(dá)量達(dá)到高峰，其中張亞2號中的表達(dá)量最高，隴亞10號次之，R2-17最低。在成熟期時，張亞2號中的表達(dá)量依然大于隴亞10號和R2-17(圖3)。

圖3 GPAT9基因在3個胡麻品種不同發(fā)育階段的根、莖、葉、花和種子中的相對表達(dá)量Fig. 3 Relative expression level of GPAT9 gene in different developing roots, stems, leaves, flower and seeds stages of three flax varieties R，開花初期的根；R1，開花后10 d的根；R2，開花后20 d的根；R3，開花后30 d的根；R4，開花后40 d的根；R5，開花后50 d的根；S，開花初期的莖；S1,開花后10 d的莖；S2，開花后20 d的莖；S3，開花后30 d的莖；S4，開花后40 d的莖；S5，開花后50 d的莖；L，開花初期的葉；L1，開花后10 d的葉；L2，開花后20 d的葉；L3，開花后30 d的葉；L4，開花后40 d的葉；F，開花初期的花；10D～50D，開花后10～50 d種子的發(fā)育階段。圖中種子不同發(fā)育階段基因的相對表達(dá)量以張亞2號開花初期的根為對照，表達(dá)量設(shè)為“1”。豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(SE，n=3)。下同。R, root in early flowering; R1, root in 10th day after flowering; R2, root in 20th day after flowering; R3, root in 30th day after flowering; R4, root in 40th day after flowering; R5, root in 50th day after flowering; S, stem in early flowering; S1, stem in 10th day after flowering; S2, stem in 20th day after flowering; S3, stem in 30th day after flowering; S4, stem in 40th day after flowering; S5, stem in 50th day after flowering; L, leaves in early flowering; L1, leaves in 10th day after flowering; L2, leaves in 20th day after flowering; L3, leaves in 30th day after flowering; L4, leaves in 40th day after flowering; F, flowers in early flowering; 10D-50D, seeds developing stages. Results are shown as the relative expression of genes at different developing stages by comparing to root expression of Zhangya 2, which was set as “1”. Bars represent standard error (SE, n=3). The same below.

2.3.2DGAT1和DGAT2基因表達(dá)分析DGAT1基因在各個組織中均有表達(dá)，主要在發(fā)育后期的種子中表達(dá)量最高，在根、莖、葉中表達(dá)量不高。在種子中，張亞2號DGAT1基因的表達(dá)逐漸增高，R2-17和隴亞10號中先增高，到成熟期時又下降(圖4)。DGAT2和DGAT1的表達(dá)模式大致相同。張亞2號中，DGAT2的表達(dá)量是逐漸增高；R2-17的表達(dá)量是先增高，到成熟期時迅速降低；隴亞10號的表達(dá)量是先增高，到開花后40 d下降，持續(xù)下降到成熟期(圖5)。到成熟期時，DGAT1和DGAT2在張亞2號的表達(dá)量最高，隴亞10號次之，R2-17最低。

2.3.3PDAT1和PDAT2基因表達(dá)分析PDAT1基因在各個組織中均有表達(dá)，主要在開花后30 d的根中和開花后20 d的種子中表達(dá)量高。在根中，PDAT1基因在開花后30 d表達(dá)量達(dá)到最高，隨后開始下降；在莖中，張亞2號的表達(dá)是先增高后降低，R2-17和隴亞10號逐漸增高；在葉中，表達(dá)逐漸增高。在種子中，在開花后20 d表達(dá)量達(dá)到最高，張亞2號最高，R2-17次之，隴亞10號最低，隨后開始下降；到成熟期時，張亞2號中的表達(dá)量依然高于R2-17和隴亞10號(圖6)。PDAT2基因的表達(dá)模式和PDAT1截然不同。PDAT2基因在開花初期的葉中表達(dá)量達(dá)到最高，在根和莖中次之，在種子中最低。在葉中，開花初期的表達(dá)量最高，然后逐漸下降(圖7)。

圖4 DGAT1基因在3個胡麻品種不同發(fā)育階段的根、莖、葉、花和種子中的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression level of DGAT1 gene in different developing roots, stems, leaves, flower and seeds stages of three flax varieties

圖5 DGAT2基因在3個胡麻品種不同發(fā)育階段的根、莖、葉、花和種子中的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression level of DGAT2 gene in different developing roots, stems, leaves, flower and seeds stages of three flax varieties

圖6 PDAT1基因在3個胡麻品種不同發(fā)育階段的根、莖、葉、花和種子中的相對表達(dá)量Fig.6 Relative expression level of PDAT1 gene in different developing roots, stems, leaves, flower and seeds stages of three flax varieties

圖7 PDAT2基因在3個胡麻品種不同發(fā)育階段的根、莖、葉、花和種子中的相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression level of PDAT2 gene in different developing roots, stems, leaves, flower and seeds stages of three flax varieties

2.3.4FAD2A和FAD3A基因表達(dá)分析FAD2A基因在各個組織中均有表達(dá)，開花后20 d的種子中表達(dá)量最高，在根、莖和葉中表達(dá)量很低。在種子中，開花后20 d，張亞2號中的表達(dá)量最高，隴亞10號次之，R2-17中最低(圖8)。FAD3A基因的表達(dá)模式與FAD2A大致相同，但是在開花后20 d，張亞2號中的表達(dá)量最高，R2-17次之，隴亞10號中最低(圖9)。

圖8 FAD2A基因在3個胡麻品種不同發(fā)育階段的根、莖、葉、花和種子中的相對表達(dá)量Fig.8 Relative expression level of FAD2A gene in different developing roots, stems, leaves, flower and seeds stages of three flax varieties

圖9 FAD3A基因在3個胡麻品種不同發(fā)育階段的根、莖、葉、花和種子中的相對表達(dá)量Fig.9 Relative expression level of FAD3A gene in different developing roots, stems, leaves, flower and seeds stages of three flax varieties

2.4 含油量和脂肪酸組分與相關(guān)基因表達(dá)量相關(guān)性分析

含油量、不飽和脂肪酸含量與相關(guān)基因表達(dá)量的關(guān)系如表3所示。含油量與亞麻酸含量呈極顯著正相關(guān)(P≤0.01)。與含油量呈顯著正相關(guān)的基因是DGAT1、DGAT2、PDAT1(P≤0.05)，與亞麻酸呈顯著正相關(guān)的基因是PDAT1(P≤0.05)。與含油量和亞麻酸都呈顯著正相關(guān)的基因是PDAT1(P≤0.05)。DGAT1、DGAT2和PDAT1在張亞2號種子不同發(fā)育階段的累積表達(dá)量顯著高于R2-17和隴亞10號(圖10和圖11)。與PDAT1基因呈極顯著正相關(guān)的是基因GPAT9和FAD2A(P≤0.01)，與PDAT1呈顯著相關(guān)的基因是FAD3A(P≤0.05)。油酸、亞油酸與亞麻酸呈負(fù)相關(guān)，PDAT1與油酸和亞油酸也呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

胡麻是中國尤其是北方非常重要的一種油料作物，也是亞麻酸含量很高的油料作物。研究表明，不同品種(系)的胡麻，其含油量和亞麻酸含量差異很顯著。本研究結(jié)果表明，胡麻種子發(fā)育過程中，在開花后10～20 d，種子內(nèi)油脂快速積累，高油材料張亞2號的油脂積累速率高于低油材料，且隨著種子發(fā)育一直在升高。低油材料的種子發(fā)育后期，油脂的含量會有一定幅度的下降，表明了不同品種的油脂積累模式可能不同。低油材料在種子發(fā)育后期，可能由于脂肪降解酶表達(dá)量增高，脂肪快速降解用于植物種子的萌發(fā)，從而導(dǎo)致了含油量的小幅下降，這種現(xiàn)象在油料種子中是非常普遍的。在海甘藍(lán)(Crambeabyssinica)，煙草(Nicotianatabacum)和擬南芥種子成熟過程中也有類似的報道[34]。胡麻種子發(fā)育過程中各脂肪酸組分隨著種子發(fā)育呈現(xiàn)一定變化規(guī)律，3個材料的亞油酸的積累呈下降趨勢，亞麻酸的積累呈上升趨勢。3個材料的亞麻酸含量同油脂積累的模式一樣，都在開花后10～20 d增長迅速，高亞麻酸材料的積累一直在持續(xù)增高直到成熟期，低亞麻酸材料的積累在持續(xù)下降或在發(fā)育后期下降。由此可見，胡麻開花后10～20 d是油脂和亞麻酸積累的關(guān)鍵時期，不同品系的油脂和亞麻酸積累模式不相同，高油高亞麻酸品系中油脂和亞麻酸含量都在持續(xù)增高，低油低亞麻酸品系油脂和亞麻酸的積累在發(fā)育后期降低。

表3 含油量、脂肪酸組分與相關(guān)基因表達(dá)量相關(guān)性分析Table 3 Pearson’s correlation analysis between oil content, fatty acid and expression levels of related genes

注：“*”表示顯著相關(guān) (P≤0.05)，“**”表示極顯著相關(guān) (P≤0.01)。表中，LIN：亞麻酸；LIO：亞油酸；OLE：油酸；GPAT：甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶；DGAT：酰基輔酶A：二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶；PDAT：磷脂二?；视王；D(zhuǎn)移酶；FAD：脂肪酸去飽和酶。

Note：“*” indicates significant correlation (P≤0.05), “**” indicates extremely significant correlation (P≤0.01). LIN: linolenic acid; LIO: linoleic acid; OLE: oleic acid; GPAT: glycerol-3-phosphate acyltransferase; DGAT: acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase; PDAT: phospholipid: diacylglycerol acyltransferase; FAD: fatty acid desaturase.

圖10 3個胡麻品種在種子成熟期的含油量及與含油量相關(guān)基因在種子發(fā)育階段的累積表達(dá)量Fig.10 Total oil content and cumulative expression level of correlative genes of three flax varieties in seeds developing stage

圖11 3個胡麻品種在種子成熟期的亞麻酸及與亞麻酸相關(guān)基因PDAT1在種子發(fā)育階段的累積表達(dá)量Fig.11 Linolenic acid content and cumulative expression level of correlative gene PDAT1 of three flax varieties in seeds mature stage

豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(SE，n=3)。不同大寫字母代表不同材料間含油量與相關(guān)基因表達(dá)量的差異極顯著(P≤0.01)。Bars represent standard error (SE,n=3). The different uppercase letters denote significance at 0.01 level.

對胡麻TAG合成代謝途徑中關(guān)鍵基因表達(dá)分析結(jié)果表明，GPAT9、DGAT1&DGAT2、PDAT1&PDAT2和FAD2A&FAD3A從胡麻開花初期到成熟期的根、莖、葉、花和種子中都有表達(dá)，但表達(dá)模式有顯著差異。除了PDAT2和GPAT9之外，其他基因在種子中的表達(dá)量都是很高的。通過相關(guān)性分析表明，與含油量和亞麻酸都呈顯著正相關(guān)的基因是PDAT1(P≤0.05)，這與Pan等[10]的研究結(jié)果一致。PDAT被認(rèn)為是DGAT功能的補(bǔ)充，PDAT和DGAT共同發(fā)揮作用來催化合成TAG。DGAT1、DGAT2、PDAT1和PDAT2重組在酵母缺失突變體中表達(dá)時，都能恢復(fù)TAG的合成；外源添加ALA時，能刺激PDAT1和PDAT2的酶活性。胡麻中的PDATs具有將ALA裝配到TAG中的獨(dú)特功能，它能促進(jìn)包含ALA?；糠值腡AG合成[10]。本研究中，PDAT1的表達(dá)模式與油脂和亞麻酸的積累模式一致，在高油高亞麻酸材料中，無論是在油脂和亞麻酸積累的快速期或成熟期，PDAT1的表達(dá)量都高于低油低亞麻酸材料。由此可見，PDAT1可能是影響胡麻不同品種(系)油脂和亞麻酸積累的關(guān)鍵基因。

與含油量呈顯著正相關(guān)的基因還有DGAT1和DGAT2(P≤0.05)。有研究發(fā)現(xiàn)DGAT1基因突變體可限制野生型擬南芥的TAG合成，而過量表達(dá)DGAT1基因可增加種子含油率11%～28%[35]。在某些高油脂含量和特殊脂肪酸含量高的植物如油桐、蓖麻等中，DGAT2在植物油脂合成積累過程中呈現(xiàn)很高的表達(dá)量，在這些植物中DGAT2可能對于種子中TAG的積累作用比DGAT1更為重要。我們的研究結(jié)果也顯示，DGAT2的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DGAT1和其他基因。DGAT1和DGAT2的表達(dá)模式一致，但在不同材料中表達(dá)模式差異顯著。在高油高亞麻酸材料中，DGAT1和DGAT2的表達(dá)一直持續(xù)增高到成熟期；在低油低亞麻酸材料中，DGAT1和DGAT2的表達(dá)都是先增高，在發(fā)育后期降低。我們把3個品種(系)中與含油量和亞麻酸呈顯著正相關(guān)的DGAT1、DGAT2和PDAT1基因在種子5個發(fā)育階段的表達(dá)量累積起來比較，發(fā)現(xiàn)高油高亞麻酸材料中DGAT1、DGAT2和PDAT1的累積表達(dá)量顯著高于低油低亞麻酸材料。

與PDAT1呈極顯著正相關(guān)的基因有GPAT9和FAD2A(P≤0.01)，呈顯著正相關(guān)的基因有FAD3A(P≤0.05)。Shockey等[36]利用人工合成的miRNA使擬南芥GPAT9 (At5g60620)基因沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擬南芥種子含油量較野生型下降了26%～44%。我們發(fā)現(xiàn)GPAT9在開花初期的葉和發(fā)育后期的莖中含量最高，這與Kuo等[37]研究結(jié)果相似，該研究發(fā)現(xiàn)GPAT主要集中在葉片、形成和發(fā)育中的種子中表達(dá)。GPAT9在種子中的表達(dá)模式與PDAT1相似，在油脂的快速積累期有明顯的表達(dá)量高峰，且高油材料中GPAT9的表達(dá)顯著高于低油材料。與GPAT9的表達(dá)模式相似，PDAT2在開花初期的葉中表達(dá)最高，在整個種子發(fā)育階段表達(dá)量都不高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他基因的表達(dá)量，可能GPAT9和PDAT2在植物營養(yǎng)組織里有不同的生理功能。FAD2A和FAD3A在種子中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他基因，在亞麻酸的快速積累期表達(dá)量最高，且高亞麻酸材料中的表達(dá)量顯著高于低亞麻酸材料。

4 結(jié)論

胡麻開花后10～20 d是油脂和亞麻酸的快速積累期，但不同品種(系)的油脂和亞麻酸的動態(tài)積累模式差異顯著。高油高亞麻酸材料中油脂和亞麻酸的積累趨勢在整個種子發(fā)育階段都在持續(xù)增高；低油材料中油脂和亞麻酸的積累趨勢在開花后20 d呈緩慢下降趨勢；低亞麻酸材料中油脂和亞麻酸的積累趨勢先增高，后下降。PDAT1、DGAT1和DGAT2這3個基因的動態(tài)表達(dá)模式與含油量的動態(tài)積累模式呈顯著正相關(guān)，PDAT1的動態(tài)表達(dá)模式與亞麻酸含量的動態(tài)積累模式呈顯著正相關(guān), 且在高油高亞麻酸材料的種子動態(tài)發(fā)育階段中PDAT1基因的累積表達(dá)量也顯著高于低油低亞麻酸材料。PDAT1可能是影響胡麻不同品種(系)中含油量和亞麻酸含量的關(guān)鍵基因。