Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ）在斑馬魚組織中的累積及對(duì)抗氧化系統(tǒng)的影響

馬珊珊，趙光輝，常文越 *，劉 智 ，張依然，陳紅星，謝凌天

（1.沈陽(yáng)環(huán)境科學(xué)研究院，沈陽(yáng) 110167；2.遼寧省城市生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110167；3.沈陽(yáng)工程學(xué)院遼寧省潔凈燃燒發(fā)電與供熱技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110136；4.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽(yáng)110016；5.華南師范大學(xué)環(huán)境研究院環(huán)境理論化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006）

硒是生物體必需元素，魚類中有40多種硒蛋白，其中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）通過(guò)過(guò)氧化氫和有機(jī)氫過(guò)氧化物來(lái)保護(hù)魚類組織抵抗過(guò)氧化反應(yīng)，而硒蛋白P（Se1P）在金屬解毒方面發(fā)揮重要作用[1-2]。然而，硒的必需性和毒性之間的界限非常狹窄[3-5]。當(dāng)攝食硒濃度在0.15～0.7 mg·kg-1時(shí)，魚體增重，GPX活性最優(yōu)，可維持生物體機(jī)能平衡[6-9]；而當(dāng)攝食濃度在3～4 mg·kg-1時(shí)，會(huì)對(duì)魚類造成不利影響[10-12]。已有野外觀測(cè)研究發(fā)現(xiàn)，硒對(duì)魚類的毒害作用包括魚種群減少、生殖障礙、發(fā)育畸形等[13-15]。美國(guó)加利福尼亞凱斯特森（Kesterson）濕地硒污染案例顯示，農(nóng)業(yè)排水的硒濃度為140～1400 μg·L-1時(shí)，會(huì)導(dǎo)致魚類和水禽的畸變和死亡[16]。水生態(tài)系統(tǒng)中的硒主要以氧化態(tài)的無(wú)機(jī)陰離子形式存在：亞硒酸鹽[Se（Ⅳ）]和硒酸鹽[Se（Ⅵ）][17]。隨著硒環(huán)境污染（包括富硒土壤灌溉排水、煉油廠釋放、燃煤電廠飛灰等）不斷增加[18]，硒的毒性影響研究得到越來(lái)越多的關(guān)注[19]。

硒的毒性機(jī)制研究主要集中在兩方面：一方面歸因于硒和硫的化學(xué)性質(zhì)相似，硒替換硫元素，從而減少巰基對(duì)細(xì)胞的氧化影響；另一方面是硒在蛋白合成中對(duì)氨基酸的替換作用[20]。硒暴露對(duì)生物體氧化脅迫的生化指標(biāo)包括谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、脂質(zhì)過(guò)氧化、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等[21-24]。機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)是防御污染脅迫的第一道屏障，當(dāng)魚體所處的水環(huán)境受到污染時(shí)，水體中污染物通過(guò)呼吸或攝食進(jìn)入魚體，之后通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入其他組織器官，進(jìn)而對(duì)魚體產(chǎn)生影響[21-22]。CAT作為重要的抗氧化因子，是表征生物體健康變化的良好生物標(biāo)記[23]。同時(shí)，總抗氧化能力（T-AOC）代表機(jī)體在受到脅迫后的防御能力，是用于衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)[24]。還有研究表明，在水生生物的生長(zhǎng)、發(fā)育以及繁殖過(guò)程中，Na+/K+-ATPase對(duì)滲透調(diào)節(jié)和離子調(diào)控起著重要的作用，而且Na+/K+-ATPase對(duì)金屬離子的暴露非常敏感[25-29]。以前有關(guān)硒的研究，大部分集中在硒與其他污染物的相互作用，探討硒對(duì)于生物體暴露污染物（如汞、鉛、鉻、鎘）的保護(hù)作用[30-32]，或者是集中在硒對(duì)生物體繁殖（如胚胎發(fā)育、產(chǎn)卵量）的影響研究[6，33]，近年來(lái)，將生物機(jī)體抗氧化因子作為反映污染物對(duì)魚類等機(jī)體損傷程度的生態(tài)毒理指標(biāo)已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用[12，21，34-36]。斑馬魚（Danio rerio）體型小、繁殖周期短、繁殖力強(qiáng)，短時(shí)間易獲得大量個(gè)體，對(duì)毒物敏感，是毒理學(xué)試驗(yàn)理想的模式生物[37]。鑒于水相暴露硒對(duì)斑馬魚的影響研究相對(duì)較少，且缺乏Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ）毒性的對(duì)比研究，本研究以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)生物，研究水相暴露Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ）在斑馬魚腦、鰓、肝、腸和肌肉組織中的硒累積情況，以及對(duì)過(guò)氧化氫酶（CAT）、總抗氧化能力（T-AOC）和Na+/K+-ATPase活性的影響，以期為硒的生態(tài)毒理效應(yīng)及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

供試生物斑馬魚（Danio rerio）購(gòu)于沈陽(yáng)市水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)，為4個(gè)月大的成魚，屬于鯉科短魚丹屬淡水魚，是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織推薦的模式生物。將斑馬魚置于實(shí)驗(yàn)室水族箱（40 cm×35 cm×30 cm，長(zhǎng)×寬×高）中馴養(yǎng)兩周，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，馴養(yǎng)期間斑馬魚活動(dòng)均正常，無(wú)病，死亡率低于3%。

1.1.2 主要試劑

亞硒酸鈉[Se（Ⅳ）]和硒酸鈉[Se（Ⅵ）]均購(gòu)自Sigma公司，純度≥99.0%，色譜級(jí)濃硝酸（70%）購(gòu)自阿拉丁，過(guò)氧化氫酶（CAT）、總抗氧化能力（T-AOC）和Na+/K+-ATPase測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

試驗(yàn)用水為中等硬度水（MHR），硬水的配方為：NaHCO3192 mg·L-1、CaSO494.9 mg·L-1、MgSO4·7H2O 246 mg·L-1和KCl 8 mg·L-1。所用試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。試驗(yàn)中各種溶液的配制用水均為去離子水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取大小相近且健康的斑馬魚（平均體長(zhǎng)3.08 cm，平均體重158.36 mg），前期研究結(jié)果表明Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ）對(duì)斑馬魚的96 h-LC50分別為3.95 mg·L-1和40.8 mg·L-1，Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ）濃度分別設(shè)置為1/8的96 h-LC50，即500 μg·L-1和5000 μg·L-1。試驗(yàn)共設(shè)置3組，空白對(duì)照組、Se（Ⅳ）處理組（500 μg·L-1）和Se（Ⅵ）處理組（5000 μg·L-1）。每組3個(gè)平行，魚缸的長(zhǎng)×寬×高為35 cm×25 cm×20 cm，暴露液體積為10 L，每缸隨機(jī)放置斑馬魚10尾。試驗(yàn)期間每2 d換一次水，暴露時(shí)間為28 d[38]。每日投喂基礎(chǔ)餌料2次，連續(xù)曝氣。暴露期間各魚缸均無(wú)斑馬魚死亡記錄。光暗周期比為16 h∶8 h，水溫（24±1）℃，pH值6.8，溶解氧8.0～8.2 mg·L-1，硬度以CaCO3計(jì)為（250 ± 25）mg·L-1。

1.2.2 樣品采集

暴露時(shí)間結(jié)束后，每缸隨機(jī)選取斑馬魚擦干表面，解剖，迅速取出斑馬魚的腦、鰓、肝、腸和肌肉組織樣品，用冰生理鹽水（0.75%NaCl和0.03%KCl）清洗血液，濾紙吸干，稱取適量置于試管中，置-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 樣品測(cè)定

斑馬魚組織樣品Se元素的測(cè)定參照GB 5009.93—2010方法[39]，利用雙道原子熒光光度計(jì)（AFS-9700A）測(cè)定。整個(gè)測(cè)定過(guò)程中用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW10024-扇貝組織，計(jì)量科學(xué)研究院）進(jìn)行分析質(zhì)量控制，回收率為98%。

過(guò)氧化氫酶（CAT）、總抗氧化能力（T-AOC）和Na+/K+-ATPase的測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行[40-44]。將各組織樣品按1∶9質(zhì)量體積比（m∶V）加入預(yù)冷生理鹽水，冰浴勻漿，離心取上清備用。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Bradford法[45]。CAT活性單位定義為每毫克組織蛋白酶分解1 μmol H2O2的量為1個(gè)活性單位（U·mg-1protein）。T-AOC定義為在30℃條件下，每分鐘每毫克組織蛋白使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時(shí)，為1個(gè)總抗氧化能力單位（U·mg-1protein）。Na+/K+-ATPase活性單位定義為每小時(shí)每毫克蛋白分解ATP產(chǎn)生1 μmol無(wú)機(jī)磷量為1個(gè)活性單位（μmol Pi·h-1·mg-1protein）。試驗(yàn)中每個(gè)指標(biāo)3個(gè)平行，將測(cè)定的平均值作為最終結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所得的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚各組織中硒累積含量

斑馬魚各組織中硒累積含量如圖1所示。與對(duì)照組相比，Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ）處理組斑馬魚肝組織中硒累積量最高，分別為（9.62±0.82）μg·g-1和（7.86±0.27）μg·g-1。Se（Ⅳ）與Se（Ⅵ）處理組相比，斑馬魚腦、腸和肌肉組織中硒累積含量差異不顯著（P＞0.05），肝和鰓組織中硒累積含量顯著升高（P＜0.05），其中肝組織中硒累積量顯著升高22.4%。

2.2 斑馬魚各組織中CAT活性

斑馬魚各組織中CAT活性如圖2所示。與對(duì)照組相比，Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ）處理組，斑馬魚肌肉組織中CAT活性分別顯著增加33.3%和7.6%（P＜0.05）。腸組織中CAT活性分別顯著降低22.5%和19.7%（P＜0.05）。Se（Ⅳ）與Se（Ⅵ）處理組相比，斑馬魚腦、鰓和腸組織CAT活性差異不顯著（P＞0.05），肝和肌肉組織中CAT活性差異顯著（P＜0.05），其中肝組織中CAT活性顯著下降13%。

2.3 斑馬魚各組織中T-AOC活性

斑馬魚各組織中T-AOC活性如圖3所示。與對(duì)照組相比，Se（Ⅳ）處理組斑馬魚鰓和腸組織以及Se（Ⅵ）處理組斑馬魚鰓、肝和腸組織中T-AOC活性均顯著下降（P＜0.05），而Se（Ⅳ）處理組斑馬魚腦組織中T-AOC活性顯著升高（P＜0.05）。

Se（Ⅳ）與Se（Ⅵ）處理組相比，斑馬魚肌肉組織中T-AOC活性差異不顯著（P＞0.05），而腦、鰓、肝和腸組織中T-AOC活性差異顯著（P＜0.05），其中鰓和肝組織中T-AOC活性分別顯著升高4.0倍和1.8倍。

2.4 斑馬魚各組織中Na+/K+-ATPase活性

斑馬魚各組織中Na+/K+-ATPase活性如圖4所示。與對(duì)照組相比，Se（Ⅳ）處理組斑馬魚鰓和肝組織以及Se（Ⅵ）處理組斑馬魚腦、鰓、肝、腸和肌肉組織中Na+/K+-ATPase活性均顯著降低（P＜0.05）。Se（Ⅳ）處理組斑馬魚肌肉組織中Na+/K+-ATPase活性顯著升高（P＜0.05）。

Se（Ⅳ）與Se（Ⅵ）處理組相比，斑馬魚鰓組織中Na+/K+-ATPase活性差異不顯著（P＞0.05），而腦、肝、腸和肌肉組織中Na+/K+-ATPase活性差異顯著（P＜0.05），其中Se（Ⅵ）處理組斑馬魚肝組織中Na+/K+-ATPase活性降低更明顯。

3 討論

3.1 硒對(duì)斑馬魚各組織中金屬元素含量的影響

圖1 對(duì)照組和硒處理組中斑馬魚腦、鰓、肝、腸、肌肉組織中總硒含量（n=3）Figure 1 Se levels in brain，gill，liver，intestine and muscle of control and Se-exposed zebrafish groups（n=3）

本研究中，Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ）處理組斑馬魚肝組織中硒累積量最高，分別為（9.62±0.82）μg·g-1和（7.86±0.27）μg·g-1。類似的硒暴露魚的研究表明，10 μg·L-1Se（Ⅳ）暴露30 d后，藍(lán)鰓太陽(yáng)魚的肝組織中硒累積量為3.0～6.6 μg·g-1，黑鱸魚的肝組織中硒累積量為5.0～7.4 μg·g-1[46]。200 μg·L-1Se（Ⅳ）暴露14 d和 28 d后，紅鯛魚的肝組織中硒累積量分別為13 μg·g-1和18 μg·g-1[38]。肝臟是魚的消化和代謝器官，對(duì)重金屬的代謝起著非常重要的作用。因?yàn)楦闻K的解毒作用，使其成為魚組織中污染物累積的主要部位[47-49]。

本研究中Se（Ⅳ）比Se（Ⅵ）更容易在斑馬魚肝和鰓組織中累積，且累積得更快。類似的關(guān)于硒暴露水生生物的研究表明，4 μg·L-1Se（Ⅳ）暴露10 d后，搖蚊幼蟲的Se（Ⅳ）累積量達(dá)14 μg·g-1，然而同樣濃度的Se（Ⅵ）暴露的累積量可以忽略不計(jì)[50]。15 μg·L-1Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ）暴露14 d后，Se（Ⅳ）暴露組寡毛綱帶絲蚓的硒累積含量是Se（Ⅵ）暴露組的2倍[25]。Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ）處理組斑馬魚組織中硒累積量的差異，可能是由于Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ）的化學(xué)性質(zhì)不同，硒酸鹽進(jìn)入細(xì)胞是通過(guò)和硫酸根一樣的離子通道[51]。Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ）被魚吸收，首先在魚鰓中進(jìn)行累積，然后分布到魚的各組織中[46]。然而，Se（Ⅳ）比Se（Ⅵ）具有更強(qiáng)的化學(xué)活性，在一些情況下，Se（Ⅳ）還沒有被吸收就會(huì)被快速地還原成硒化物，從而更穩(wěn)定地合成到動(dòng)物組織中[52]，這可以部分解釋Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ）在魚組織中累積量的不同。

3.2 硒對(duì)斑馬魚各組織中CAT活性的影響

酶類是生物體內(nèi)所有生化反應(yīng)的中間體，任何生化反應(yīng)都可以通過(guò)酶活性來(lái)反映生化反應(yīng)的變化。我們通過(guò)測(cè)定斑馬魚各組織的酶活性來(lái)了解水相暴露硒對(duì)魚體機(jī)能的影響程度。

CAT作為生物體內(nèi)主要的抗氧化酶之一，正常情況下會(huì)聯(lián)合SOD酶清除機(jī)體內(nèi)的活性自由基，使自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，機(jī)體維持低而有效的自由基濃度，保護(hù)機(jī)體免受自由基傷害[53]。然而，環(huán)境污染脅迫會(huì)導(dǎo)致機(jī)體自由基產(chǎn)生過(guò)多，抗氧化系統(tǒng)受到損傷，使抗氧化酶的活性改變，脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致各種病理生理過(guò)程發(fā)生[54-55]。

圖2 對(duì)照組和硒處理組中斑馬魚腦、鰓、肝、腸、肌肉組織中CAT活性（n=3）Figure 2 CAT activity in brain，gill，liver，intestine and muscle of control and Se-exposed zebrafish groups（n=3）

本研究中，硒處理組與對(duì)照組相比，斑馬魚肌肉組織中CAT均顯著增加，說(shuō)明硒累積可以誘導(dǎo)CAT活性的增加，這可能是由于累積在魚體內(nèi)的硒，激發(fā)了大量的超氧化物陰離子自由基，CAT參與解毒作用所致[10，25]。同樣的，Misra等[23]研究表明，虹鱒魚肝組織暴露有機(jī)硒24 h后，CAT活性顯著升高。Weekley等[56]關(guān)于有機(jī)硒的作用機(jī)制研究也表明這一點(diǎn)。本研究中，硒處理組與對(duì)照組相比，斑馬魚腸組織中CAT均顯著降低，而且Se（Ⅳ）與Se（Ⅵ）處理組相比，斑馬魚肝組織中CAT活性顯著下降，表明過(guò)量的硒累積可能會(huì)引發(fā)大量自由基的產(chǎn)生，從而壓制抗氧化酶（如CAT、SOD等）的清除能力，進(jìn)而導(dǎo)致ROS的增加，CAT活性下降[10]。Pacini等[57]研究表明，白鱘魚暴露有機(jī)硒30 d，肝組織中CAT的活性隨著硒累積的增加顯著降低。本研究中，Se（Ⅳ）處理組斑馬魚肝組織的硒累積量顯著高于Se（Ⅵ）處理組，同時(shí)，硒處理組斑馬魚肝組織中硒的累積量顯著高于肌肉組織，這些也從側(cè)面證實(shí)了本研究中硒累積導(dǎo)致的CAT活性變化的情況。

3.3 硒對(duì)斑馬魚各組織中T-AOC活性的影響

T-AOC是近年研究發(fā)現(xiàn)的用于衡量機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)，它的大小可代表和反映機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)對(duì)外來(lái)刺激的代償能力以及機(jī)體自由基代謝的狀態(tài)[58-61]。王春鳳[35]研究表明暴露高汞組染毒5 d時(shí)，劍尾魚鰓和肝組織T-AOC分別降低了39%和30%，而高汞加硒組的T-AOC有明顯升高的趨勢(shì)，表明機(jī)體硒可以通過(guò)與汞離子結(jié)合降低汞離子對(duì)機(jī)體的毒害作用，提高機(jī)體的抗氧化能力。本研究中，與對(duì)照組相比，Se（Ⅳ）處理組斑馬魚鰓和腸組織以及Se（Ⅵ）處理組斑馬魚鰓、肝和腸組織中T-AOC活性均顯著下降。表明Se可以通過(guò)破壞機(jī)體細(xì)胞膜的完整性和降低酶的活性來(lái)降低機(jī)體的抗氧化能力[35]。本研究硒處理組斑馬魚腸組織中CAT活性顯著降低也能很好地佐證這一點(diǎn)。本研究中，Se（Ⅳ）與Se（Ⅵ）處理組相比，斑馬魚鰓和肝組織中T-AOC活性顯著升高，Se（Ⅳ）處理組斑馬魚腦組織中T-AOC活性顯著高于對(duì)照組。類似研究報(bào)道表明，無(wú)機(jī)硒暴露仔豬或大鼠導(dǎo)致肝組織中T-AOC活性增加[62-63]。隨著硒累積量的增加，T-AOC活性顯著升高，可能是由于硒累積造成GSH-Px和SOD活性升高引起的[64-65]。

3.4 硒對(duì)斑馬魚各組織中Na+/K+-ATPase活性的影響

圖3 對(duì)照組和硒處理組中斑馬魚腦、鰓、肝、腸、肌肉組織中T-AOC活性（n=3）Figure 3 T-AOC activity in brain，gill，liver，intestine and muscle of control and Se-exposed zebrafish groups（n=3）

Na+/K+-ATPase主要負(fù)責(zé)通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜共軛Na+和K+的流入和排出。Na+/K+-ATPase酶長(zhǎng)時(shí)間受到抑制是一種毒性影響，會(huì)導(dǎo)致離子調(diào)控能力下降、形態(tài)學(xué)改變、心臟停搏，最終導(dǎo)致生物體死亡[35]。Na+/K+-ATPase是多種毒物作用的靶點(diǎn)，金屬與有機(jī)物均被認(rèn)為是Na+/K+-ATPase的強(qiáng)抑制劑。本研究中，硒處理組與對(duì)照組相比，Se（Ⅳ）處理組斑馬魚鰓和肝組織以及Se（Ⅵ）處理組斑馬魚腦、鰓、肝、腸和肌肉組織中Na+/K+-ATPase活性均顯著下降，說(shuō)明硒在斑馬魚組織中的累積，導(dǎo)致組織能量得不到充足的供應(yīng)，代謝活動(dòng)受到干擾，抵抗力降低，加速了組織的衰老及死亡[25]。這與Evans等[66]的研究一致，硒暴露水生寡毛綱動(dòng)物后，Na+/K+-ATPase活性顯著降低，而這種酶的持續(xù)抑制，會(huì)降低離子調(diào)控能力、改變生物體形態(tài)、心臟停搏，最終導(dǎo)致機(jī)體死亡。也有文獻(xiàn)研究表明，Se（Ⅳ）和有機(jī)硒的暴露情況下，Na+/K+-ATPase酶活性的變化有所不同，說(shuō)明不同形態(tài)的硒可能對(duì)Na+/K+-ATPase的活性變化產(chǎn)生不同的影響，氧化態(tài)的硒（如+4價(jià)或+2價(jià)的硒）具有抑制Na+/K+-ATPase活性的能力，而0價(jià)或-2價(jià)的硒不具有抑制Na+/K+-ATPase活性的能力[67]，這也從側(cè)面解釋了本文中Se（Ⅵ）比Se（Ⅳ）處理組斑馬魚肝組織中Na+/K+-ATPase活性下降更明顯這一現(xiàn)象，可能是因?yàn)?6價(jià)的硒比+4價(jià)的硒具有更強(qiáng)的抑制Na+/K+-ATPase酶活性的能力。另外，本研究中Se（Ⅳ）處理組與對(duì)照組相比，斑馬魚肌肉組織中Na+/K+-ATPase活性顯著升高，Se（Ⅵ）處理組斑馬魚肌肉組織中Na+/K+-ATPase活性顯著降低。我們發(fā)現(xiàn)，Se（Ⅳ）處理組肌肉組織中硒的累積量顯著高于對(duì)照組，Se（Ⅵ）處理組肌肉組織中硒的累積量與對(duì)照相比差異不顯著。說(shuō)明硒的形態(tài)與硒的累積量相比，對(duì)Na+/K+-ATPase活性抑制的影響可能占主導(dǎo)地位。此外，也有研究表明，虹鱒魚幼魚在水相Se（Ⅵ）暴露情況下，不論是急性暴露3.6 mg·L-14 d還是亞急性毒性暴露0.36 mg·L-130 d，均沒有檢測(cè)到鰓組織中Na+/K+-ATPase活性的變化[25]。這可能是因?yàn)椴煌谋┞稘舛群捅┞稌r(shí)間情況下，不同的水生生物組織中Na+/K+-ATPase活性變化存在差異所致。

Na+/K+-ATPase酶抑制會(huì)破壞魚的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，損害質(zhì)膜或線粒體膜，最終導(dǎo)致生物體自身代謝活動(dòng)受到抑制。ATPase擔(dān)負(fù)著各種離子的跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)娜蝿?wù)，在維持生物電現(xiàn)象、保持鹽分、水分平衡和非電解質(zhì)運(yùn)輸中具有非常重要的作用。很多研究報(bào)道認(rèn)為ATPase能被重金屬離子抑制，是因?yàn)檫@些重金屬可以通過(guò)與膜上蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)（如含巰基結(jié)構(gòu)或氧基結(jié)構(gòu)的基團(tuán)）結(jié)合后，引起蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生變化，這種變化阻止了底物與蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而抑制了正常酶的活性[68]。這符合Na+/K+-ATPase的作用機(jī)理-構(gòu)象變化假說(shuō)[69]，即Na+/K+-ATPase本身的構(gòu)象變化調(diào)節(jié)著Na+和K+的運(yùn)輸。硒累積導(dǎo)致Na+/K+-ATPase酶受抑制的機(jī)制研究相對(duì)較少，硒的這種毒性作用可能與硒的化學(xué)性質(zhì)和硫相似有關(guān)，可以在合成蛋白的時(shí)候?qū)⒘蛱鎿Q[17]，引起酶的構(gòu)象發(fā)生變化，從而使酶活性中心的構(gòu)型和低介電區(qū)域發(fā)生變化，進(jìn)而影響底物與酶的靠近及定向，底物分子中的敏感性發(fā)生變化，最終影響Na+/K+-ATPase活性。

圖4 對(duì)照組和硒處理組中斑馬魚腦、鰓、肝、腸、肌肉組織中Na+/K+-ATPase活性（n=3）Figure 4 Na+/K+-ATPase activity in brain，gill，liver，intestine and muscle of control and Se-exposed zebrafish groups（n=3）

4 結(jié)論

（1）水相暴露硒導(dǎo)致斑馬魚各組織呈現(xiàn)不同程度的硒累積，硒處理組斑馬魚肝組織中硒累積量最大，Se（Ⅳ）比Se（Ⅵ）更容易在斑馬魚肝和鰓組織中累積，具有更高的生物可利用性。

（2）硒累積導(dǎo)致模式生物斑馬魚組織發(fā)生不同程度的氧化脅迫。

（3）CAT、T-AOC和Na+/K+-ATPase生化指標(biāo)的研究，為進(jìn)一步從抗氧化系統(tǒng)的角度研究硒暴露對(duì)魚類等水生生物的毒性作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。