HBeAg對髓樣樹突狀細(xì)胞Toll樣受體4及NF-κB信號通路的影響

燕飛 湯永志 朱堅勝 朱敏 陳華忠 劉均艷

全球約20億人感染過HBV，約3.5億人是慢性HBV攜帶者，每年約有60萬人死于急、慢性HBV感染[1]。HBV感染后，機體通過細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)殺死或抑制感染細(xì)胞內(nèi)的病毒，控制HBV感染。目前認(rèn)為，機體對HBV固有免疫和特異性免疫反應(yīng)不足是導(dǎo)致病毒持續(xù)感染的主要原因[2]。有效的天然免疫反應(yīng)和相對較強、持續(xù)、多特異性的T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，在HBV感染機體后的免疫清除中起著重要作用[3]。樹突狀細(xì)胞（DC）是脊椎動物免疫系統(tǒng)的前哨，具有捕捉和表達(dá)抗原的特殊能力[4-5]。在機體清除HBV的免疫反應(yīng)中，DC作為抗原提呈細(xì)胞而起著重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝患者體內(nèi)DC成熟障礙和功能缺陷[6]。DC表面有廣泛的病原分子模式，能產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)信號，以激活宿主反應(yīng)來識別病原，其中Toll樣受體（TLR）最具特征性。TLR是一類跨膜模式識別受體，廣泛表達(dá)于特異性免疫細(xì)胞和非特異性免疫細(xì)胞，它在促進先天免疫反應(yīng)中起著重要作用[7]。相關(guān)研究表明，TLR4在肝病進展中起著重要作用[8-9]。本研究通過體外培養(yǎng)將單核細(xì)胞誘導(dǎo)為髓樣DC（mDC），并探討HBeAg對mDC TLR-4及NF-κB信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 重組人粒細(xì)胞巨嗜細(xì)胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、rh IL-4購自美國 R&D 公司；HBeAg購自以色列Prospec公司；抗人FITC-人類白細(xì)胞抗原-DR、抗人CD11c-PE、同亞型對照抗體購自美國Ebioscience公司；細(xì)胞增殖檢測（MTS）試劑購自美國Promega公司；脂多糖（LPS）購自美國Sigma-aldrich公司；RIPA-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；FBS購自美國Gibco公司。

1.2 mDC體外誘導(dǎo)分化 采集并分離健康志愿者外周血，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液梯度離心法獲得單核細(xì)胞；用無血清RIPA-1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，在37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)2h，PBS洗去非貼壁細(xì)胞，獲得貼壁的單核細(xì)胞；加入含 20%FBS的 RIPA-1640培養(yǎng)基，rh GM-CSF 750IU/ml、rh IL-4 870IU/ml誘導(dǎo)培養(yǎng)，隔日半量換液并補充rh GM-CSF、rh IL-4，第7天收集懸浮細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞形態(tài)及表型鑒定 收集培養(yǎng)7d的mDC，在掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；使用抗人FITC-人類白細(xì)胞抗原-DR、抗人CD11c-PE標(biāo)記，采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表型。

1.4 HBeAg刺激mDC 在培養(yǎng)7d的mDC中加入HBeAg 5μg/ml或不加 HBeAg（對照組），培養(yǎng) 24h；每孔加入LPS 1μg/ml培養(yǎng)，第9天收集懸浮細(xì)胞。

1.5 HBeAg對TLR4、NF-κB信號通路蛋白表達(dá)的影響采用Western blot法檢測。收集上述各組培養(yǎng)9d的mDC，提取蛋白；將各組蛋白等量上樣，經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入 TLR4、NF-κB 一抗，4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2h，增強化學(xué)發(fā)光法顯色。采用紫外投射凝膠成像系統(tǒng)掃描后，應(yīng)用Quantlty one軟件進行灰度值分析。計算樣本目的蛋白灰度值/內(nèi)參基因條帶灰度值的比值，即蛋白相對表達(dá)量。

1.6 HBeAg對mDC刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力的影響 采用MTS法。同樣密度梯度離心法分離另一正常人外周血單核細(xì)胞，經(jīng)貼壁2h后收集非貼壁細(xì)胞，用含20%FBS的RIPA-1640培養(yǎng)基重新懸浮作為淋巴細(xì)胞；收集第9天各組mDC，經(jīng)絲裂霉素C處理后作為刺激細(xì)胞。mDC 與淋巴細(xì)胞按 1∶5、1∶10、1∶20 的比例加入96孔板，共培養(yǎng)4d。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入MTS試劑孵育 4h，檢測其吸光度（A）。刺激指數(shù)=（A實驗組-本底）（/A對照組-本底）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mDC體外培養(yǎng)形態(tài)及表型鑒定 外周血單核細(xì)胞加入rh GM-CSF、rh IL-4培養(yǎng)7d，光鏡下可見懸浮細(xì)胞胞體增大，細(xì)胞表面可見較多樹杈樣突起，見圖1ab；電鏡下可見細(xì)胞表面粗糙，邊緣短小毛刺樣突起，為典型mDC形態(tài)特征，見圖1c。rh GM-CSF+rh IL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)7d的懸浮細(xì)胞中，CD11c/HLA-DR雙陽性細(xì)胞比例為（86.2±1.85）%，明顯高于單純培養(yǎng)組的（9.01±1.12）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 2。

圖1 mDC體外培養(yǎng)7d光鏡及電鏡下所見（a：光鏡下，×100；b：光鏡下，×400；c：電鏡下，×6 510）

圖2 rh GM-CSF+rh IL-4誘導(dǎo)組與單純培養(yǎng)組雙陽性細(xì)胞比例的比較

2.2 HBeAg對TLR4、NF-κB信號通路蛋白表達(dá)的影響 培養(yǎng)至第9天，HBeAg刺激組TLR4、NF-κB相對表達(dá)量為 0.12±0.01、0.75±0.12，分別低于對照組的0.27±0.03、1.20±0.13，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；提示HBeAg抑制mDC TLR4信號通路蛋白表達(dá)，見圖3。2.3 HBeAg對mDC刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力的影響 在 DC/淋巴細(xì)胞比例為 1∶5、1∶10、1∶20 的反應(yīng)中，HBeAg 刺激組刺激指數(shù)為 2.93±0.05、2.56±0.19、1.44±0.09，分別低于對照組的 4.83±0.05、3.57±0.35、2.13±0.11，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；提示HBeAg減弱mDC刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力。

圖3 培養(yǎng)至第9天HBeAg對通路蛋白表達(dá)的影響（a：NF-κB；b：TLR4）

3 討論

HBV持續(xù)感染是導(dǎo)致肝硬化、肝功能衰竭和肝細(xì)胞癌的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝患者針對HBV的特異性免疫應(yīng)答減弱，CD8+細(xì)胞增殖能力及功能均下降[10]。在慢性乙肝患者體內(nèi)激活HBV特異性免疫應(yīng)答，可以有效控制病毒復(fù)制并減輕肝臟損傷[6]?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為，免疫耐受可能是導(dǎo)致慢性HBV感染的一個關(guān)鍵因素，但是具體機制仍不清楚。

近年來，DC在慢性HBV感染免疫學(xué)發(fā)病機制中的作用受到重視。mDC是一種功能強大的抗原提呈細(xì)胞，在調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能方面具有重要作用。受微生物抗原刺激后，mDC可分泌大量IL-12、IFN-γ，從而誘導(dǎo)Th1分化。最近研究表明，慢性HBV感染患者DC功能明顯受損[6,11]。Vander等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在慢性乙肝患者體內(nèi)mDC數(shù)量減少。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，與HBsAg攜帶者比較，免疫耐受患者DC表面 CD80、CD86及 HLA-DR表達(dá)下降，刺激淋巴細(xì)胞增殖能力下降，IL-12分泌減少，與HBVDNA呈負(fù)相關(guān)；同時，DC功能對HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換具有重要作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，健康者外周血來源的mDC與HBsAg共培養(yǎng)后，可刺激T細(xì)胞能力增強，IL-12分泌增多[14]，DC對HBV復(fù)制的抑制作用增強[6]。可見，DC在慢性HBV感染的發(fā)病機制中具有重要作用。

HBV的一種或多種抗原可能利用多種途徑抑制針對HBV的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致針對HBV的免疫耐受。HBeAg對HBV感染和復(fù)制并不是必需的；但有研究表明HBeAg對慢性HBV感染是必需的，且可能在慢性乙肝患者免疫應(yīng)答中起著免疫調(diào)節(jié)作用[10,15]。Purvina等[16]研究證實HBeAg通過IL-1信號抑制T淋巴細(xì)胞增殖，反過來又促進慢性感染的發(fā)生。另一研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBeAg可通過下調(diào)IL-18介導(dǎo)的IFN-γ表達(dá)來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[17]。Chen等[10]研究結(jié)果顯示，HBeAg可以抑制淋巴細(xì)胞的增殖，減少IFN-γ的產(chǎn)生，這可能是HBV免疫耐受的分子機制之一。健康者單核細(xì)胞來源的mDC經(jīng)HBeAg刺激后，淋巴細(xì)胞增殖能力明顯減弱，即HBeAg刺激后的mDC免疫應(yīng)答反應(yīng)明顯減弱，但通過什么信號途徑調(diào)節(jié)DC功能尚不清楚。TLR4通過病原體相關(guān)分子模式識別病原體，從而激活下游NF-κB、MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起下游細(xì)胞因子分泌增加，發(fā)揮重要的免疫作用。研究發(fā)現(xiàn)TLR4的激活可抑制HBV感染，且TLR4的抗病毒作用通過NF-κB途徑進行[18]。然而，HBeAg抑制了TLR介導(dǎo)的炎癥轉(zhuǎn)錄因子、NF-κB和IFN-β的激活[19]，可能是慢性HBV感染的原因之一。但是，關(guān)于HBeAg能否通過TLR4信號通路影響DC功能，目前仍不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBeAg刺激mDC后，TLR4、NF-κB蛋白相對表達(dá)量明顯下降；TLR4及下游NF-κB蛋白被抑制后，mDC刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力明顯減弱。可見，HBeAg通過TLR4及NF-κB信號通路抑制DC的特異性免疫反應(yīng)。

綜上所述，HBeAg刺激mDC后，可抑制TLR4及NF-κB信號通路，減弱DC的免疫功能，可能是HBV免疫耐受的機制之一，這為認(rèn)識持續(xù)HBV感染的形成原因提供了新信息。由于TLR4下游有NF-κB和MAPK通路，因此進一步研究HBeAg是否通過影響MAPK信號通路來抑制DC免疫功能，有助于從分子機制方面闡明持續(xù)HBV感染的原因。