抹茶對(duì)實(shí)驗(yàn)性小鼠急性酒精性肝損傷的干預(yù)作用研究

王 英 劉慧芳 樓招歡

酒精性肝?。ˋLD）在我國已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，尋找合適的藥物或治療手段以防控ALD的發(fā)生發(fā)展，已是當(dāng)務(wù)之急。已知大量乙醇攝入后其代謝過程中產(chǎn)生的活性氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化是急性酒精性肝損傷的重要發(fā)病機(jī)制。植物性酚類物質(zhì)可以提高酶類抗氧化劑的活性，提高機(jī)體清除自由基的能力，減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷；天然抗氧化植物及其成分已成為抗急性酒精性肝損傷藥物研究的熱點(diǎn)[1-3]。綠茶多酚是綠茶的主要活性成分，前期研究發(fā)現(xiàn)，綠茶多酚通過抗氧化應(yīng)激，阻抑細(xì)胞色素C釋放，對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用[4]。抹茶是新鮮綠茶經(jīng)特殊工藝制成超細(xì)粉末，最大程度地保留了綠茶多酚等有效成分，且易被人體吸收，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景[5]。課題組前期發(fā)現(xiàn)抹茶具有良好的降血脂作用，能夠改善模型高脂血癥模型大鼠肝功能指標(biāo)，降低肝指數(shù)，具有一定的保肝作用[6]。但其對(duì)酒精性肝損傷的作用尚未見有報(bào)道。本文觀察抹茶對(duì)急性酒精性肝損傷模型小鼠肝功能指標(biāo)及氧化相關(guān)指標(biāo)的影響，以期為抹茶的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

表1 抹茶對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠體質(zhì)量的影響（g

表1 抹茶對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠體質(zhì)量的影響（g

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；正常對(duì)照組和模型對(duì)照組予純水灌胃；聯(lián)苯雙酯組按照0.1mL·10g-1體質(zhì)量灌胃0.375mg·mL-1聯(lián)苯雙酯溶液；抹茶組按0.1mL·10g-1體質(zhì)量灌胃0.1g·mL-1抹茶溶液

?

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 清潔級(jí)ICR小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量24～25g，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（浙）2008-0033。于室溫 25±2℃，相對(duì)濕度50%～70%飼養(yǎng)，自由采食飲水。

1.2 儀器設(shè)備 東芝ACCUTETBA-40FR全自動(dòng)生化分析儀（東芝三廠醫(yī)療株式會(huì)社）；Power Wave340酶標(biāo)儀（美國Bio-TEK公司）；XHF-b高速分散器（內(nèi)切式勻漿機(jī)）（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.3 藥物及試劑 抹茶，由紹興御茶村茶業(yè)有限公司提供。陽性藥：聯(lián)苯雙酯滴丸（規(guī)格：1.5mg，浙江萬邦藥業(yè)有限公司，批號(hào)130115）堿性磷酸酶（ALP，20140113）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批號(hào)20140305）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST，批號(hào)：20140227）試劑盒，購自杭州唐榮科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD，批號(hào)20140415）、丙二醛（MDA，批號(hào)20140412）、考馬斯亮藍(lán)（批號(hào)20140411）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及處理 取ICR小鼠，稱定體質(zhì)量，按組間體質(zhì)量均衡原則分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、聯(lián)苯雙酯組（3.75mg·kg-1）、抹茶組（1.0g·kg-1），每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組于每天上下午分別按0.1mL/10g體質(zhì)量灌胃給予稀釋1倍的52度紅星二鍋頭，連續(xù)9天復(fù)制急性酒精性肝損傷模型；自造模第1天起，除正常對(duì)照組及模型對(duì)照組灌胃給予純水外，其余各給藥組按0.1mL/10g體質(zhì)量灌胃量分別灌胃給予0.375mg·mL-1聯(lián)苯雙酯溶液和0.1g·mL-1抹茶溶液，每天1次，連續(xù)9天。

2.2 一般體征觀察 每日稱定各組小鼠體質(zhì)量并記錄，觀察毛發(fā)、活動(dòng)等情況。

2.3 血生化指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后，各組小鼠禁食不禁水 12h，摘眼球取血，離心（4000r/min，10min），取血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各小鼠血清肝功能指標(biāo)（AST、ALT、ALP）。

2.4 肝臟指數(shù)檢測(cè) 采血后，解剖各小鼠，迅速分離肝臟，稱定肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)。肝指數(shù)=肝重/體質(zhì)量×100%。

2.5 肝組織MDA水平及SOD活性檢測(cè) 精確稱取0.5g肝組織，用生理鹽水制作成10%肝組織勻漿，離心，取上清，測(cè)定肝組織MDA含量；另取肝組織0.5g同法制成1%肝組織勻漿，離心，取上清，測(cè)定肝組織蛋白含量及SOD活性。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析多重比較；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠體質(zhì)量的影響 與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量從造模開始（第2天）逐日下降（P＜0.01）；與模型組比較，抹茶能改善過量酒精攝入所導(dǎo)致的體質(zhì)量減輕癥狀。見表1。

3.2 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝功能指標(biāo)的影響與正常組比較，急性酒精性肝損傷小鼠血清ALT（P＜0.01）、AST（P＜0.05）及 ALP 活性增加；與模型組比較，抹茶對(duì)ALT、AST無顯著性影響，但能顯著降低血清 ALP 活性（P＜0.01），見表 2。

3.3 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠臟器系數(shù)的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯和抹茶均能有效降低模型小鼠肝臟指數(shù)（P＜0.01）。提示抹茶可以緩解急性酒精性肝損傷小鼠的肝腫大，見表3。

表2 各組急性酒精性肝損傷小鼠肝功能指標(biāo)比較（U/L

表2 各組急性酒精性肝損傷小鼠肝功能指標(biāo)比較（U/L

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶；AST：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶；ALP：堿性磷酸酶；正常對(duì)照組和模型對(duì)照組予純水灌胃；聯(lián)苯雙酯組按照0.1mL·kg-1體質(zhì)量灌胃0.375mg·mL-1聯(lián)苯雙酯溶液；抹茶組按0.1mL·kg-1體質(zhì)量灌胃0.1g·mL-1抹茶溶液

?

表3 各組急性酒精性肝損傷小鼠肝指數(shù)比較（

表3 各組急性酒精性肝損傷小鼠肝指數(shù)比較（

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型組比，**P＜0.01；正常對(duì)照組和模型對(duì)照組予純水灌胃；聯(lián)苯雙酯組按照0.1mL·kg-1體質(zhì)量灌胃0.375mg·mL-1聯(lián)苯雙酯溶液；抹茶組按0.1mL·kg-1體質(zhì)量灌胃0.1g·mL-1抹茶溶液

?

3.4 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝組織MDA水平明顯升高（P＜0.05），SOD 活性顯著下降（P＜0.05）；與模型組比，聯(lián)苯雙酯和抹茶能顯著降低模型小鼠肝組織 MDA 水平（P＜0.01，P＜0.05），提高肝組織 SOD活性（P＜0.01），見表 4。

表4 各組急性酒精性肝損傷小鼠肝組織MDA水平和SOD活性比較（

表4 各組急性酒精性肝損傷小鼠肝組織MDA水平和SOD活性比較（

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；正常對(duì)照組和模型對(duì)照組予純水灌胃；聯(lián)苯雙酯組按照0.1mL·kg-1體質(zhì)量灌胃0.375mg·mL-1聯(lián)苯雙酯溶液；抹茶組按0.1mL·kg-1體質(zhì)量灌胃0.1g·mL-1抹茶溶液

?

4 討論

經(jīng)胃腸道吸收的乙醇約90%在肝細(xì)胞內(nèi)通過胞漿ADH和線粒體ALDH途徑、微粒體CYP2E1乙醇氧化系統(tǒng)途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)CAT途徑氧化代謝，上述代謝過程產(chǎn)生的大量自由基介導(dǎo)了肝細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而損傷肝細(xì)胞[7]。機(jī)體內(nèi)存在包括SOD等酶類及包括還原型谷胱甘肽（GSH）等非酶類兩大抗氧化防御體系，以清除氧自由基，阻斷組織過氧化損傷；MDA是活性氧自由基氧化生物膜過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其水平的高低與氧化應(yīng)激對(duì)肝臟的損害程度相關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，1天2次給予經(jīng)稀釋的紅星二鍋頭，模型小鼠體質(zhì)量明顯減輕，血清ALT、AST及ALP水平增加，肝指數(shù)增大，肝組織MDA水平顯著升高，SOD活性顯著降低，提示模型小鼠肝功能受損且可能存在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。給予抹茶干預(yù)，能有效拮抗模型小鼠體質(zhì)量減輕，降低肝組織MDA水平，提高SOD活性，改善肝腫大。提示抹茶對(duì)急性酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，該作用可能與其通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。