鴿新城疫病毒毒力致弱株的拯救及免疫原性分析

蔣艷玉，趙莎莎，孫娜娜，孫軍峰，孔憲剛，劉勝旺，劉懷然

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽呼吸道病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江哈爾濱150069)

新城疫(Newcastle disease，ND)是嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)的病毒性傳染病，其病原為新城疫病毒(NDV)。NDV可長期在鴿群中潛伏感染，應(yīng)激條件下致發(fā)病，其臨床癥狀與雞相似，常見腸炎、下痢和神經(jīng)癥狀，以嗜神經(jīng)速發(fā)型多見，發(fā)病和死亡率受品種、日齡、應(yīng)激、飼養(yǎng)條件等影響差別較大[1-3]。鴿源NDV與雞NDV同屬副黏病毒血清I型，但鴿NDV在進(jìn)化上形成獨(dú)立的分支：ClassII類基因Ⅵb型，與目前常用疫苗株(ClassII系基因Ⅰ、Ⅱ型)抗原性差異較大，因而現(xiàn)有疫苗對鴿群免疫效果不佳，導(dǎo)致鴿群普遍性的高帶毒率和發(fā)病率[4-5]。因此需要根據(jù)鴿ND特點(diǎn)，研制基于基因Ⅵb型的鴿專用ND疫苗，有效保障鴿養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。

NDV毒力與其F蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸順序和組成密切相關(guān)?；诜聪蜻z傳技術(shù)構(gòu)建重組病毒株研究表明，La Sota F蛋白裂解位點(diǎn)氨基酸序列突變?yōu)閺?qiáng)毒株相應(yīng)位點(diǎn)，病毒毒力增強(qiáng)[6]；反之，將強(qiáng)毒株F蛋白裂解位點(diǎn)突變?yōu)長a Sota相應(yīng)位點(diǎn)，病毒株毒力相應(yīng)由強(qiáng)毒變?yōu)槿醵綶7-8]，據(jù)此構(gòu)建的病毒株已經(jīng)用于ND疫苗生產(chǎn)[8]。目前有多篇關(guān)于各NDV反向遺傳技術(shù)研究報(bào)道，均用于基礎(chǔ)研究，未見有致弱株用于疫苗應(yīng)用的報(bào)道[9]。本研究在構(gòu)建鴿NDV反向遺傳操作平臺基礎(chǔ)上，將病毒F蛋白裂解位點(diǎn)突變?yōu)長a Sota相應(yīng)序列，構(gòu)建和拯救毒力致弱的重組病毒并進(jìn)行免疫原性評價(jià)，以獲得免疫原性良好的鴿ND疫苗株。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料鴿NDV Pi/CH/LHLJ/110822(簡稱0822)株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存[10]，MDT=63 h，ICPI=1.19；重組痘病毒 vTF-3、穩(wěn)定表達(dá) T7 RNA聚合酶的BSR-T7/5細(xì)胞由步志高研究員惠贈(zèng)[11]；pOLTV5轉(zhuǎn)錄載體由Peeters惠贈(zèng)[12]；V4株輔助質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[12]；SPF雞胚和雞紅細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；IN-FUSION試劑盒購自Clontech公司；pCI-neo載體購自 Invitrogen公司；LipofectamineTM2000、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等均購自NEB公司；pUC18-F1-4由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

1.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中NDV 0822株基因序列(JX486554)和pOLTV5載體序列，0822株和疫苗株La Sota序列，設(shè)計(jì)2對突變引物 FF1/FR1和FF2/FR2用于構(gòu)建F裂解位點(diǎn)突變質(zhì)粒pOLTV5-FCS。病毒株基因組鑒定所用的短片段擴(kuò)增引物見文獻(xiàn)[3]。引物由華大基因公司合成(表1)。

1.3 NDV 0822基因組F蛋白裂解位點(diǎn)突變轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建將pOLTV5載體用引物PV5F與PV5R擴(kuò)增線性化后利用In-fusion試劑盒與用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切線性化的質(zhì)粒PUC18-F1-4連接，構(gòu)建以pOLTV5為載體的含0822基因組全長cDNA的轉(zhuǎn)錄載體pOLTV5-0822FL。利用引物FF1/FR1與FF2/FR2通過overlapping PCR對0822病毒株F基因進(jìn)行點(diǎn)突變，將F蛋白裂解位點(diǎn)序列由112RRQKRF117突變?yōu)長a Sota株的112GRQGRL117，擴(kuò)增片段通過酶切位點(diǎn)亞克隆至同樣酶切處理的pOLTV5-0822FL載體，篩選重組質(zhì)粒并測序，陽性重組質(zhì)粒命名為pOLTV5-0822FL-FCS。

表1 實(shí)驗(yàn)中用到的關(guān)鍵引物Table 1 Important primers in this study

1.4 病毒拯救及鑒定待BSR-T7/5細(xì)胞生長至80%～90%時(shí)，于6孔板內(nèi)每孔加入重組痘病毒vTF-3 200 μL(約 103pfu)作用 1 h。將總量約 10 μg 上述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒與 V4株輔助質(zhì)粒 pCI-NP-K，pCI-P-K，pCI-L-K按照 4∶2∶1∶1比例混合，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000操作說明轉(zhuǎn)染接種vTF-3的BsR-T7/5細(xì)胞，4 h～6 h后加入阿拉伯糖苷，換為5%血清的 DMEM；24 h后加入 TPCK；72 h后收取細(xì)胞液，反復(fù)凍融后取上清液接種9日齡SPF雞胚尿囊腔，3 d后收取尿囊液以NDV陽性血清進(jìn)行病毒的HA/HI試驗(yàn)。對HI陽性病毒提取RNA擴(kuò)增其F基因和含有遺傳標(biāo)記部位的基因片段進(jìn)行測序鑒定并分析，鑒定正確的拯救親本病毒命名為r0822-21A，r0822-17A，F(xiàn)蛋白裂解位點(diǎn)突變的拯救病毒命名為r0822-FCS。

1.5 突變毒株的主要生物學(xué)特性和遺傳穩(wěn)定性測定病毒株r0822經(jīng)CEF 3代飾斑純化， r0822-FCS株經(jīng)3代雞胚有限稀釋法純化，分別進(jìn)行SPF雞胚擴(kuò)繁，測定r0822和r0822-FCS病毒株對1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)、最小致死量，致死雞胚平均死亡時(shí)間(MDT)、雞胚半數(shù)感染量(EID50)和對CEF半數(shù)感染量(TCID50)。將r0822-FCS株在雞胚連續(xù)傳代20次，收集每一代的尿囊液檢測HA，并用5、10、15、20代的雞胚尿囊液進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增病毒F基因和遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，并測序后評價(jià)其遺傳穩(wěn)定性。

1.6 r0822-FCS對雞的安全性評價(jià)將15只3日齡SPF雛雞分成2組，第一組10只，滴鼻點(diǎn)眼接種r0822-FCS原倍尿囊液0.1 mL，第二組5只采用0.1 mL PBS滴鼻點(diǎn)眼作為對照。兩組在相同條件下分別飼養(yǎng)、觀察15 d，第7 d、10 d、14 d采血測定血清抗體HI效價(jià)。免疫后2周，用基因Ⅶ型雞源強(qiáng)毒株NDV/HLJ/01/06株以106EID50/0.1 mL/只肌肉注射攻毒，記錄SPF雞發(fā)病死亡情況。

1.7 r0822-FCS病毒株接種SPF雞的免疫效力測定將14日齡SPF雞24只平均分為2組，經(jīng)滴鼻點(diǎn)眼分別接種 105EID50和 106EID50的 r0822-FCS病毒液，另設(shè)空白對照6只，于接種后的 4 d、7 d、14 d采血清測抗體效價(jià)。

1.8 r0822-FCS病毒株滅活疫苗對SPF雞免疫效力測定將15只20日齡SPF雞分為2組，第一組10只，每只肌肉接種0.3 mL按常規(guī)方法制備的油佐劑滅活r0822-FCS疫苗；第二組5只SPF雞接種0.3 mL PBS作為對照。2組在相同條件下分別飼養(yǎng)，每隔7 d采血檢測HI抗體效價(jià)。

1.9 r0822與r0822-FCS病毒株基因組序列分析將r0822-21A、r0822-17A病毒株在CEF中連續(xù)純化3代，每代次挑取3個(gè)～5個(gè)病毒蝕斑經(jīng)CEF擴(kuò)繁、提取RNA反轉(zhuǎn)錄后選用合適位置引物(含重組起始或終止位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測序后比較各代次病毒蝕斑間序列情況。r0822-FCS病毒株則直接比較經(jīng)雞胚有限稀釋純化的1代、3代以及第7代病毒的L基因序列。對3株病毒測序結(jié)果進(jìn)行分析比對。

2 結(jié)果

2.1 重組病毒的拯救及初步鑒定應(yīng)用V4株輔助質(zhì)粒拯救病毒，結(jié)果顯示：r0822-21A和r0822-17A為親本病毒基因組拯救病毒；r0822-FCS為F蛋白裂解位點(diǎn)突變基因組拯救病毒，測序顯示r0822-FCS的F蛋白裂解位點(diǎn)已經(jīng)突變?yōu)長a Sota株相應(yīng)序列，NheI遺傳位點(diǎn)存在。

2.2 拯救病毒株的主要生物學(xué)特性NDV毒力致病指數(shù)測定結(jié)果顯示，r0822-FCS的ICPI值由親本病毒的1.19降低為0.08，MDT值由63 h升至168 h以上，表明F蛋白位點(diǎn)突變病毒株致病性降低，由中等毒力病毒株變?yōu)槿醵局辍Ａ硗?，r0822-FCS在雞胚中的病毒復(fù)制滴度由親本株的10-7.71Log10 EID50/0.1 mL降低至10-2.25Log10 EID50/0.1 mL，顯示其與La Sota、V4等傳統(tǒng)弱毒疫苗株相似的特征。r0822-21A和r0822-17A病毒株的MDT值與親本病毒株相差不大，符合中等毒力株特征，2株病毒的雞胚及CEF復(fù)制滴度稍低于親本株。r0822-17A的ICPI值(0.55)與親本病毒(1.19)相差較多，呈現(xiàn)弱毒株的 ICPI值特征(表 2)。

表2 NDV 0822株及其拯救病毒株主要生物學(xué)參數(shù)測定Table 2 The major biological characteristics of NDV0822 and its rescuing strains

2.3 重組病毒r0822-FCS病毒株遺傳穩(wěn)定性評價(jià)0822-FCS在雞胚中連續(xù)傳代，其第 5、10、15、20代病毒經(jīng)擴(kuò)增測序，其F蛋白裂解突變位點(diǎn)均穩(wěn)定存在，表明病毒株遺傳穩(wěn)定性良好。

2.4 重組病毒r0822-FCS的安全性評價(jià)r0822-FCS原倍尿囊液接種3日齡SPF雞后，在觀察期內(nèi)健康狀況良好，表明病毒株安全性良好。與傳統(tǒng)NDV弱毒株接種雞抗體效價(jià)相比，r0822-FCS接種14 d抗體HI效價(jià)約3 log2，抗體滴度嚴(yán)重偏低，屬于非正?，F(xiàn)象。以基因Ⅶ型雞源強(qiáng)毒株NDV/HLJ/01/06株攻毒后，發(fā)病率為72.72%(8/11)，死亡率為54.54%(6/11)，對照組全部死亡(5/5)(表3)，表明r0822-FCS對3日齡SPF雞僅具有部分保護(hù)效果。

2.5 重組病毒r0822-FCS滅活疫苗對SPF雞的免疫效果r0822-FCS病毒經(jīng)滅活、乳化后免疫20日齡SPF雞，試驗(yàn)結(jié)果顯示14 d抗體HI效價(jià)可達(dá)(7.5±1.12)log2，21 d 達(dá)到(9.1±1)log2，表明該病毒滅活疫苗免疫SPF雞后可刺激其產(chǎn)生高水平血清抗體。

表3 r0822-FCS毒株的安全性評價(jià)和免疫效力測定Table 3 The safety evaluation and immunogenicity measurement of NDV r0822-FCS strain in SPF chicken

2.6 拯救病毒的基因組序列測定分析經(jīng)對3株拯救病毒進(jìn)行全基因組序列測定分析，顯示3株病毒L基因位置均出現(xiàn)不同長度的與親本病毒株差異較大基因片段，序列分析顯示這些片段與V4病毒株的L基因相應(yīng)片段同源性較高，替換區(qū)域與V4的核酸、氨基酸差異均不超過 2個(gè)(表 4)。其中r0822-21A病毒株L基因僅在末尾的57個(gè)核酸片段與0822同源，其L基因幾乎全被V4的L基因替換。r0822-21A、r0822-17A病毒株均經(jīng)過3輪CEF蝕斑純化，每代次選擇3～5個(gè)蝕斑進(jìn)行PCR產(chǎn)物(包含異常基因起始位點(diǎn)或終位點(diǎn))測序，結(jié)果顯示，所有蝕斑測序結(jié)果高度一致，表明2株病毒株高度純化。r0822-FCS經(jīng)過3次雞胚有限稀釋法純化和20代繼代，其第1、3、7代的L基因測序結(jié)果均一致。據(jù)此初步推測，本研究獲得的L基因不同程度重組了V4基因的3株病毒，是由于親本病毒基因組與來自V4株的L基因輔助質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)拯救過程中發(fā)生了隨機(jī)同源基因重組的結(jié)果。

表4 拯救毒株L基因閱讀框架中重組基因片段大小及位置Table 4 Length and location of recombinant gene segments in L gene open reading frame for rescuing viruses

3 討論

基于反向遺傳技術(shù)制備的ND疫苗已經(jīng)應(yīng)用于市場[7,13]，在目前缺少鴿ND專用疫苗背景下，為應(yīng)用該技術(shù)快速獲得毒力致弱的鴿ND疫苗候選毒株，本研究選用的NDV 0822為鴿基因VIb型代表性病毒株[10]，毒力致病指數(shù)表明r0822-FCS已經(jīng)由中等毒力變?yōu)槿醵?。依照疫苗?guī)程測定，r0822-FCS對3日齡SPF雞安全性良好，但接種后7 d、14 d HI抗體很低(2Log2～3Log2)。最小免疫劑量實(shí)驗(yàn)中，r0822-FCS以105EID50/0.1 mL、106EID50/0.1 mL劑量滴鼻點(diǎn)眼接種14日齡SPF雞，未能檢測到抗體陽轉(zhuǎn)。以上動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與ND常規(guī)弱毒疫苗相比偏差較大，當(dāng)時(shí)未找到確切原因。鑒于r0822-FCS作為弱毒疫苗效果不佳，將其滅活免疫20日齡SPF雞，14 d抗體HI效價(jià)即達(dá)7.5 log2，符合ND疫苗免疫特點(diǎn)。因鴿NDV強(qiáng)毒株為基因VI型，該基因型對雞為中等毒力，所以本次實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行攻毒保護(hù)測定。

實(shí)驗(yàn)初期僅對拯救病毒進(jìn)行血清學(xué)鑒定和F基因位點(diǎn)突變確認(rèn)，后期基因組測序發(fā)現(xiàn)，r0822-21A、r0822-17A、r0822-FCS 3株病毒均在 L基因不同位點(diǎn)出現(xiàn)不同長度的與親本病毒株差異較大，而與V4株同源性高的片段。鑒于拯救體系中使用了V4病毒株的輔助質(zhì)粒，所以推測上述異常與輔助質(zhì)粒具有相關(guān)性。用La Sota病毒株基因組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒與V4輔助質(zhì)粒拯救出La Sota病毒株，用本RT-PCR體系擴(kuò)增，未發(fā)現(xiàn)L基因重組現(xiàn)象，可以排除質(zhì)粒、引物污染；3株病毒均經(jīng)過多輪CEF蝕斑或雞胚有限稀釋純化，每代次蝕斑、病毒株的PCR產(chǎn)物(包含異常基因起始位點(diǎn)或終止位點(diǎn))測序結(jié)果高度一致。V4株在CEF中增殖能力極弱，經(jīng)多代蝕斑純化后存活的可能性極小，可排除病毒不純因素。r0822-FCS病毒株以較高劑量免疫SPF雞未檢測到抗體陽轉(zhuǎn)，表明該病毒株在雞體內(nèi)復(fù)制能力極弱，同時(shí)說明未有V4病毒株污染。r0822-FCS與親本病毒株0822差異主要在于F蛋白位點(diǎn)突變和L基因部分被V4株相應(yīng)基因替換。根據(jù)目前研究報(bào)道，F(xiàn)蛋白裂解位點(diǎn)與病毒致病性相關(guān)，不會(huì)對病毒復(fù)制效率產(chǎn)生顯著影響；而L基因是NDV復(fù)制的重要相關(guān)基因，r0822-FCS病毒株在雞體表現(xiàn)出的與目前NDV病毒株明顯差異的生物學(xué)特性，與其L基因的變化密切相關(guān)。結(jié)合以上分析推測：本次應(yīng)用反向遺傳獲得的病毒株在拯救過程中與輔助質(zhì)粒的L基因發(fā)生了隨機(jī)同源重組。

單股負(fù)鏈RNA病毒自然條件下以點(diǎn)突變?yōu)橹?，尚未見到有關(guān)自然條件下基因重組病毒株的報(bào)道。實(shí)驗(yàn)條件下通過轉(zhuǎn)染或共感染，分階段的負(fù)鏈RNA病毒發(fā)生基因重組現(xiàn)象，見于漢坦病毒和A型流感病毒[14]；而單股負(fù)鏈RNA病毒基因重組發(fā)生于實(shí)驗(yàn)條件下的呼吸道合胞體病毒，2株缺陷型病毒共同感染細(xì)胞時(shí)，拯救出了一株重組病毒[15]，但極低的拯救效率提示自然條件下發(fā)生重組可能性微乎其微。具體到NDV重組現(xiàn)象，2008年前后有多篇文章基于序列分析、分離病毒測序方面的報(bào)道[16-18]引起爭論和質(zhì)疑。劉秀梵等分析指出，此前一些報(bào)道的基因重組病毒株，多系未對病毒純化、體系污染的原因[19]。Rout等研究指出，拯救NDV應(yīng)構(gòu)建同源輔助質(zhì)粒，以防止可能出現(xiàn)的異源基因重組[20]。實(shí)驗(yàn)條件下，眾多NDV反向遺傳研究中均使用異源病毒株輔助質(zhì)粒，本實(shí)驗(yàn)室也曾將La Sota病毒株、基因型VII病型毒株用V4株輔助質(zhì)粒拯救，均未發(fā)現(xiàn)基因重組現(xiàn)象。La Sota、V4活疫苗株應(yīng)用的半個(gè)多世紀(jì)以來，分子流行病學(xué)研究也未發(fā)現(xiàn)其重組病毒出現(xiàn)，所以此次實(shí)驗(yàn)中發(fā)生的L基因重組屬于實(shí)驗(yàn)條件下的偶發(fā)現(xiàn)象。具體到實(shí)驗(yàn)體系中具體何種因素導(dǎo)致這一現(xiàn)象？如此高幾率的重組(3株拯救病毒均發(fā)現(xiàn)重組)，其機(jī)制和風(fēng)險(xiǎn)是什么？尚需很多后繼研究工作分析。

根據(jù)規(guī)程規(guī)定，ND疫苗研究和評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物仍然是雞，r0822-FCS病毒株作為滅活疫苗可在雞體內(nèi)刺激產(chǎn)生高滴度抗體。本研究也用鴿進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，然而由于目前鴿群普遍攜帶NDV，篩選的陰性鴿在隔離器飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)期間發(fā)生死亡、抗原、抗體陽轉(zhuǎn)現(xiàn)象，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)無法采用。鴿子因其特殊生活習(xí)性，疾病凈化較為困難，所以鴿ND疫苗研究應(yīng)該借鑒其他研究者經(jīng)驗(yàn)，直接在鴿群中應(yīng)用滅活疫苗，采集大樣本數(shù)據(jù)來說明問題。

綜上所述，盡管r0822-FCS作為弱毒疫苗效果不佳，其仍然可以作為鴿ND滅活疫苗備選病毒株。本研究首次報(bào)道了反向遺傳操作實(shí)驗(yàn)條件下，NDV基因組與輔助質(zhì)粒之間發(fā)生了基因重組，且其L基因是決定病毒復(fù)制的關(guān)鍵基因。本研究此次報(bào)道實(shí)驗(yàn)條件下NDV發(fā)生基因重組的主要目的是想借此聽取同行研究者意見，另外提醒在進(jìn)行NDV反向遺傳操作時(shí)，如使用異源輔助質(zhì)粒，應(yīng)注意是否有同樣問題。