羊痘病毒屬病毒多重TaqMan MGB熒光定量PCR檢測方法的建立

聶福平，王 昱，劉念源，楊 俊，唐昌杰，韓雪清，王國民，陳 軍，候長軍，李應(yīng)國*

(1.重慶出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心/國家牛病重點實驗室/重慶市進境陸生動物疫病防控研究工程中心，重慶 江北 400020；2.重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院， 重慶 沙坪壩 400030；3.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；4.重慶市農(nóng)業(yè)委員會，重慶 渝北 401120)

羊痘病毒屬病毒(Capripoxvirus，CaPV)包括牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)、山羊痘病毒(Goatpoxvirus，GTPV)和綿羊痘病毒(Sheeppoxvirus，SPPV)3個成員，主要引起牛結(jié)節(jié)性皮膚病(Lumpy skin disease)。山羊痘(Goatpox)和綿羊痘(Sheeppox)，是急性、熱性、接觸性的牛、羊等反芻動物重要傳染病[1]。山羊痘和綿羊痘合稱羊痘，是所有動物痘病中最為嚴重的一種，主要表現(xiàn)發(fā)熱，無毛或少毛部位的皮膚或黏膜發(fā)生紅斑、丘疹、皰疹、水泡等，發(fā)病后成年羊死亡率約40%，羔羊死亡率可達100%。LSDV引起牛結(jié)節(jié)性皮膚病(LSD)，患牛主要表現(xiàn)皮膚、黏膜、器官表面廣泛性結(jié)節(jié)，動物消瘦、流產(chǎn)、產(chǎn)乳急劇降低，嚴重時導(dǎo)致死亡，發(fā)病率3%～85%不等。CaPV極高的傳染性及發(fā)病率，導(dǎo)致發(fā)病動物產(chǎn)奶量下降、消瘦、流產(chǎn)，甚至影響到羊毛和皮革，引起嚴重的經(jīng)濟損失。因此，羊痘和LSD均被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須申報名錄疾病[2-3]。

LSD于1929年在贊比亞地區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)，之后的50年在非洲廣泛傳播[4]。1989年在以色列暴發(fā)，證明該病已不局限于非洲[5]。2006年～2016年，該病已在亞洲、歐洲、北美洲等國家或地區(qū)迅猛傳播，如俄羅斯、塞爾維亞、希臘、科威特、夢特內(nèi)哥羅、哈薩克斯坦、納米比亞等[6-11]，造成了嚴重的經(jīng)濟損失。目前中國尚無LSD發(fā)病報道，但國內(nèi)許多地方有羊痘發(fā)病的報道[12]。隨著進口貿(mào)易的需要，各國迫切要求牛羊及其產(chǎn)品的輸華，鑒于目前LSDV的流行趨勢，我國急需儲備相應(yīng)的檢測技術(shù)。

LSDV、GTPV和SPPV三者之間關(guān)系緊密，同源性高，由于該類病毒感染主要引起細胞免疫，對于再次感染或中和抗體水平低的動物，血清學(xué)方法較難確診。痘病毒產(chǎn)生的抗體與牛丘疹性口炎、偽LSD等之間存在交叉反應(yīng)，因此瓊脂凝膠免疫擴散試驗和免疫熒光抗體試驗特異性較低。蛋白免疫印跡用于檢測痘病毒具有較好的敏感性和特異性，但費時費力和操作困難使其實際應(yīng)用中存在一定的局限性。因此血清學(xué)方法尚不能較好的鑒別LSDV、GTPV和SPPV。多重熒光定量PCR是一種特異性、敏感性和重復(fù)性均非常高的基因檢測方法。由于CaPVs基因組A+T含量非常高，因此采用新型Taq-Man-MGB探針，MGB修飾基團能夠?qū)m值提高10℃左右，使在堿基組成不理想的條件下，較大提高探針的雜交特異性與穩(wěn)定性。

本研究基于LSDV、GTPV和SPPV的兩端反向末端重復(fù)序列區(qū)(ITR)，設(shè)計特異的引物和探針，首次建立了基于TaqMan MGB熒光定量PCR技術(shù)的CaPV多重熒光定量PCR方法，該方法操作簡單、快速、特異、敏感、重復(fù)性好，可同步鑒別檢測CaPV，為CaPVs的高通量鑒別檢測奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒株LSDV野毒株(NI-2490)核酸由法國Emmanuel Albina博士惠贈；LSDV疫苗株(LW-1959)購自南非(Bio Onderstepoort)；GTPV疫苗株(CVCC AV41)、SPPV疫苗株(CVCC AV42)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛痘病毒(CPV)、豬痘病毒(SPV)均購自美國ATCC。藍舌病病毒(BTV)RNA和小反芻獸疫病毒(PPRV)RNA由云南出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心艾軍博士惠贈。

1.2 主要試劑Min BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、2×PremixExTaqTM(Probe qPCR)、pMD19-T載體、DNA Marker(DL2000)、膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司；E.Z.N.A.RBacterial DNA Kit購自O(shè)MEGA公司；Regular Agarose G-10購自Biowest公司。

1.3 引物和探針的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中登錄的LSDV、GTPV、SPPV等痘病毒的全基因序列，分析比對，設(shè)計擴增其ITR區(qū)域，構(gòu)建陽性重組質(zhì)粒標準品的通用引物(F：5'-TTGTCAGAAACG AGG-3'/R：5'-ATGCCTCACTTGTATTTGG-3')、熒光檢測通用引物(P1：5'-CCACCCCAATATTCTGCTG C-3/P2：5'-ACATTAGGGAATCATGTGCAGTGA-3')和特異的檢測探針(LSDV：5'-(VIC)-TCTTGCTA AAATGCCA-MGB-3'、GTPV：5'-(FAM)TCTTGCTA AAATACC-MGB-3'和 SPPV：5'-(NED)CTTGCTAA AATTCCA-MGB-3')。引物和探針均由上海英維捷基生物有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒標準品的構(gòu)建按照Mini BEST ViralRNA/DNA Extraction Kit說明提取 LSDV、GTPV、SPPV疫苗DNA，PCR擴增目的基因。按照DNA Purification Kit說明書步驟，回收純化PCR產(chǎn)物，將其克隆于pMD19-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒標準品。利用分光光度計測定重組質(zhì)粒的OD260nm/OD280nm比值和濃度，根據(jù)公式：陽性質(zhì)?？截悢?shù)(拷貝/μL)=(質(zhì)粒濃度×10-9×稀釋倍數(shù)×6.02×1023)/(660 道爾頓 /堿基×堿基數(shù))，計算重組質(zhì)?？截悢?shù)并作為熒光定量PCR陽性標準品。

1.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化及標準曲線的建立采用Premix ExTaqTM(Probe qPCR)推薦的 20 μL體系。在已建立的單一熒光定量PCR基礎(chǔ)上，采用正交試驗的方法，分別對引物、探針濃度、退火溫度(58℃、60℃、62℃)等進行優(yōu)化。分別以10倍連續(xù)稀釋后的陽性標準品質(zhì)粒為模板，利用優(yōu)化后的多重熒光定量PCR方法，建立標準曲線。

1.6 特異性試驗根據(jù)試劑盒說明書提取LSDV、GTPV、SPPV、CPV、SPV的基因組DNA和 BTV、PRV的總RNA，以提取的上述病毒基因組DNA以及BTV、PPRV總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用建立的CaPV多重熒光定量PCR方法進行PCR擴增，同時設(shè)立陰性對照，驗證該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗將構(gòu)建的陽性質(zhì)粒標準品進行10倍倍比稀釋，100拷貝 /μL～107拷貝 /μL共稀釋8個梯度，將其作為模板，進行熒光定量PCR檢測，驗證該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗選取 104拷貝 /μL、105拷貝 /μL、106拷貝/μL、107拷貝/μL 4個濃度的標準品，分別進行熒光定量PCR反應(yīng)，每個濃度重復(fù)3次，評價該方法的穩(wěn)定性與重復(fù)性，并計算組內(nèi)變異系數(shù)。將該陽性標準品質(zhì)粒置于-20℃保存，每隔1周進行上述重復(fù)試驗，計算其組間變異系數(shù)。根據(jù)變異系數(shù)判斷該方法的可重復(fù)性。

1.9 臨床樣品的檢測采用建立的多重熒光定量方法、OIE推薦常規(guī)PCR和病毒分離鑒定方法，對185份疑似發(fā)病羊病變組織和67份模擬臨床樣品進行檢測，比較3種方法的檢測準確性。67份模擬臨床樣品的制備：取52份牛血清樣品，15份羊抗凝血，每份含1 mL牛血清或羊抗凝血，分別添加相同濃度不同體積的LSDV、GTPV、SPPV弱毒疫苗液，其中40份為陽性，27份為模擬陰性，混勻后提取核酸，對病毒核酸進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標準品的制備以設(shè)計的通用引物對LSDV、GTPV、SPPV核酸 DNA進行普通 PCR擴增，結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物大小約250 bp，與預(yù)期大小(247 bp)相符(圖1)。將目的基因克隆于pMD19-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒標準品pMD-LSDV、pMDGTPV和pMD-SPPV，經(jīng)紫外分光光度計測定，LSDV 濃度為 4.7 μg/mL，拷貝數(shù)為 1.48×109拷貝 /μL；GPPV濃度為 10.6 μg/mL，拷貝數(shù)為 3.29×109拷貝/μL；SPPV 濃度為 8.6 μg/mL，拷貝數(shù)為 2.67×109拷貝 /μL。

圖1 LSDV、GTPV和SPPV的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 Amplifications of the specific fragments from LSDV,GTPV,and SPPV by PCR

2.2 多重熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件優(yōu)化結(jié)果利用 Premix ExTaqTM(Probe qPCR)試劑盒進行熒光定量PCR反應(yīng)，采用正交試驗的方法得出最適的引物和探針濃度，最佳退火溫度。優(yōu)化后的反應(yīng)體系為 20 μL：2×Premix ExTaqTM8 μL，LSDV 探針(10 μM)0.6 μL，GTPV 探針(10 μM)0.3 μL，SPPV探針(10 μM)3.0 μL，P1(10 μM)、P2(10 μM)各1.6 μL，DNA模板各 1 μL，其余 ddH2O補齊。最佳反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s LSDV(VIC)，GTPV(FAM)，SPPV(NED)，40 個循環(huán)。

2.3 多重熒光定量PCR標準曲線的建立以不同濃度不同病毒的質(zhì)粒標準品為模板，利用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進行擴增，以Ct值為縱坐標，不同標準品梯度稀釋的拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標獲得標準曲線，標準曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.999(R2＞0.999)，LSDV標準曲線方程為：Y=-3.32+29.61，R2=0.99937；GTPV標準曲線方程為：Y=-3.23+32.6，R2=0.99902；SPPV標準曲線方程為：Y=-3.24+33.03，R2=0.99907(圖2)。結(jié)果顯示：熒光定量PCR在梯度稀釋度范圍內(nèi)(102拷貝 /μL～107拷貝 /μL)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，依據(jù)標準曲線可以從樣品擴增的Ct值即可推算出對應(yīng)模板DNA的精確拷貝數(shù)，進而對樣品DNA進行定量分析。

圖2 多重熒光定量PCR的標準曲線Fig.2 The standard curves of the real-time PCR

2.4 特異性試驗結(jié)果應(yīng)用建立的多重熒光定量PCR方法對相關(guān)病毒的核酸進行擴增，結(jié)果顯示：該方法僅對LSDV、GTPV和SPPV的核酸有特異性擴增，對CPV、SPV、BTV、PPRV等病毒核酸均無擴增熒光信號(圖3)，表明該方法具有良好的特異性。

2.5 敏感性試驗結(jié)果將構(gòu)建的3種陽性質(zhì)粒標準品進行 10倍倍比稀釋，100拷貝 /μL～107拷貝 /μL共稀釋8個梯度，將其作為模板，進行多重熒光定量PCR的敏感性檢測，結(jié)果顯示：本研究建立的多重熒光定量PCR方法對LSDV、GTPV及SPPV核酸的最低檢測限分別為 1.48×101拷貝 /μL、3.29×101拷貝 /μL 和 2.67×101拷貝 /μL(圖 4)。

圖3 多重熒光定量PCR特異性試驗結(jié)果Fig.3 Specificity test of the multiplex real-time PCR

圖4 多重熒光定量PCR的敏感性試驗結(jié)果Fig.4 The sensitivity test of the real-time PCR for the detection of LSDV,GTPV and SPPV

2.6 重復(fù)性試驗結(jié)果對不同濃度和批次的陽性質(zhì)粒標準品進行熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示，組內(nèi)變異系數(shù)為0.22%～0.67%，組間變異系數(shù)為0.62%～1.27%(表1)，表明該檢測方法重復(fù)性良好。

2.7 臨床及模擬樣品檢測對185份臨床樣品和67份模擬臨床樣品進行不同方法比對檢測，結(jié)果顯示：本研究建立的多重熒光定量PCR法、OIE推薦的普通PCR法和病毒分離均未從185份臨床樣本中檢出LSDV、GTPV和SPPV陽性樣品。從模擬的多重病原混合樣品中，多重熒光定量PCR方法檢出40份陽性，與預(yù)期結(jié)果一致；OIE常規(guī)PCR檢出36份陽性，有4份添加低濃度的3種病原混合樣品未檢出(表2)。同時，將檢出的陽性樣品進行測序，測序結(jié)果與熒光定量PCR檢測結(jié)果的陽性率完全符合，表明該方法可以有效避免普通PCR檢測中的假陰性結(jié)果，適用于CaPV的臨床樣品鑒別檢測，且敏感性較高。

表1 多重熒光定量PCR批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗結(jié)果Table 1 The Reproducibility test of intra-and inter-assay of the real-time PCR

表2 臨床及模擬樣品方法比對檢測結(jié)果Table 2 Comparative analysis of clinical samples and simulated samples

3 討論

山羊痘、綿羊痘和LSD是牛羊重要的烈性傳染病，分別由羊痘病毒屬的GTPV、SPPV和LSDV引起。LSDV、GTPV和SPPV三者之間關(guān)系緊密，同源性極高，LSDV全基因核苷酸序列與SPPV和GTPV的同源性可高達95%～97%，SPPV與GTPV同源性為97%。無論是病毒形態(tài)、理化特性、血清學(xué)和抗原性均難以區(qū)分這3種病毒，因此有學(xué)者將LSDV、GTPV和SPPV通稱為“羊痘病毒”。SPPV和GTPV基因組大小為143 kb～147 kb，含有 147個開放閱讀框(ORFs)，包含中間編碼區(qū)(CCR)和兩端相同的 ITR。LSDV基因組約 151 kb，有 156個ORFs，包括SPPV和GTPV全部基因組，但LSDV還有一個額外基因，該基因在SPPV和GTPV是非功能性的，可能與LSDV的宿主特異性有關(guān)[13-15]。Kotwal研究表明CCR是痘病毒科保守區(qū)；ITR在羊痘病毒屬中同源性高，但與其他痘病毒相似性低[16]。因此，本研究選擇引物設(shè)計區(qū)域為ITR，特異性好。

多重熒光定量PCR是一種特異性、敏感性和重復(fù)性均非常高的基因檢測方法。但由于CaPVs基因組A+T含量非常高，因此采用新型TaqMan-MGB探針，MGB基團能有效增加探針的解鏈溫度，將Tm值提高10℃左右，較大提高探針的雜交特異性與穩(wěn)定性，解決了普通TaqMan探針需要設(shè)計較長的探針、有時特異性不強的弊端。本研究采用MGB探針原理，通過對引物濃度、探針濃度、反應(yīng)條件的優(yōu)化，保證了最佳擴增效果。通過對185份臨床樣本和67份模擬樣本的檢測，檢測結(jié)果的準確性比普通PCR高，操作比病毒分離簡便。本研究建立的多重熒光定量PCR方法可快速的鑒別檢測羊痘病毒屬的3種痘病毒，OIE陸生動物診斷(2017)手冊推薦的普通PCR方法僅適用于羊痘病毒通用檢測，不能直接鑒別LSDV、GTPV和SPPV，需通過再次測序分析比較。因此，本研究建立的多重TaqMan-MGB熒光定量PCR方法可同步鑒別檢測CaPV，具有特異、敏感、簡便、快速的特點。

本研究首次建立了單管同步鑒別檢測CaPV的多重熒光定量PCR方法，為國內(nèi)監(jiān)測CaPV，口岸防控LSD入侵和對CaPV的研究提供了特異、敏感、簡便快速的技術(shù)手段。