戊型肝炎病毒一步法多重?zé)晒舛縋CR分型鑒定技術(shù)的建立及應(yīng)用

李愛云，帥江冰，曾若雪，孫 濤，魚海瓊，朱道中，朱宇寧，張曉峰，李肖梁

(1.浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江 杭州310006；2.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 310016；3.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東 青島 266500；4.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；5.浙江大學(xué) 動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，浙江 杭州310058)

戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是一種經(jīng)糞-口傳播的急性傳染病，由戊型肝炎病毒(HEV)引起[1]，HEV廣泛分布于多種畜禽體內(nèi)，可通過水源、飲食等途徑在動(dòng)物和人之間傳播[2]，其也被認(rèn)為是人畜共患性疾病[3-4]。種系進(jìn)化研究顯示不同地區(qū)來源的HEV基因組序列存在一定的差異，可被劃分為4個(gè)主要的基因型[5]，其中基因1型和2型僅分離于人類，大規(guī)模戊型肝炎暴發(fā)流行均為該類HEV引起，基因3型和4型見于小規(guī)模流行和臨床散發(fā)，能夠感染多種哺乳動(dòng)物[6-7]，該類HEV的主要天然宿主為豬。我國流行的 HEV主要為1型和4型[8]。近年來，在我國上海、浙江等地區(qū)的豬群中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了HEV3 感染[9]。

由于目前尚未發(fā)現(xiàn)適合HEV體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞株，而且HEV感染血清學(xué)檢測的窗口期較短，熒光定量PCR技術(shù)成為目前診斷人群或動(dòng)物中HEV感染的首選方法[10]。但常規(guī)熒光定量PCR方法不能區(qū)分病原的基因型，需通過后期的PCR擴(kuò)增加測序確定感染病原的基因型，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究基于HEV1、HEV3和HEV4的基因組的型特異性，設(shè)計(jì)一對保守?cái)U(kuò)增引物和3條型特異性探針，建立一步法多重?zé)晒舛縋CR方法用以鑒別檢測不同型HEV感染，并以EGFP基因?yàn)閮?nèi)部質(zhì)控，確保從核酸提取到PCR擴(kuò)增整個(gè)過程的準(zhǔn)確和有效。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品及主要試劑32份人血清樣本由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院和杭州市第六人民醫(yī)院提供，均為HEV抗體弱陽性或可疑陽性樣品，-20℃保存?zhèn)溆谩?9份豬糞便和54份豬血清樣品采集自浙江、上海、江蘇和安徽等地區(qū)的28個(gè)規(guī)?；i場。即于不同豬舍中取1 g～2 g糞便樣品，加入0.02 mol/L PBS，徹底混勻制成 20%的懸液(w/v)，10 000 r/min離心20 min，吸取上清，-80℃保存?zhèn)溆谩?×AgPath-IDTMOne-step RT-PCR Kit購自美國Applied Biosystems公司；DNA純化試劑盒Wizard-PlusMinipreps DNA Purification System(Cat#A7100)、膠回收試劑盒Wizard PCR PrepsDNA Purification System(Cat#A7170)和體外轉(zhuǎn)錄試劑盒RiboprobeRSystem-SP6/T7均購自Promega公司；QIAamp Viral RNA mini Kit購自Qiagen公司。甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和皰疹病毒核酸樣品由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院保存。豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒株由浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院保存。

1.2 引物、探針和目的基因合成參照并分析GenBank中 HEV1株(D11092)、HEV3株(AB074918)和HEV4株(AJ272108)基因組序列，針對HEV ORF3基因序列設(shè)計(jì)一對保守引物(表1)，同時(shí)設(shè)計(jì)3條特異性針對不同基因型ORF3基因序列的探針，分別標(biāo)記熒光基團(tuán)ROX、CY5和FAM。EGFP質(zhì)控引物和探針序列參考Hoffmann等[11]設(shè)計(jì)合成。參照HEV1株(D11092)、HEV3株(AB074918)和 HEV4株(AJ272108)序列，合成針對以上擴(kuò)增引物的目的基因片段，用于標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建。

1.3 HEV陽性標(biāo)準(zhǔn)RNA和EGFP質(zhì)控RNA體外合成分別將 HEV1、HEV3、HEV4和 EGFP目的片段克隆入pGEM-T easy載體構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pGTHEV-1-ROX、pGT-HEV-3-CY5和 pGT-HEV-4-FAM以及pGT-GFP-HEX，利用試劑盒提取質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶PvuⅡ消化處理后制備末端為平端的DNA片段，純化回收后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)無RNase的Dnase I(1 U/μg)消化除去其中的DNA模板后，按RNeasy Plus mini Kit說明書對RNA進(jìn)行純化。合成的HEV陽性RNA目的片段和EGFP質(zhì)控RNA測定濃度，經(jīng)換算后分別為6.5×1011拷貝 /μL、5.3×1012拷貝 /μL、7.9×1010拷貝 /μL和 1.3×1011拷貝 /μL，保存于 -70℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 HEV擴(kuò)增引物、型特異性探針及EGFP質(zhì)控引物、探針序列Table 1 The primer and probe sequences used in the study

1.4 多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件的優(yōu)化按照AgPath-IDTMOne-step RT-PCR試劑盒說明書，以合成的HEV陽性RNA為模板，采用方陣法對多重反應(yīng)體系中各引物濃度(50 nmol/L～200 nmol/L)、探針濃度(5 nmol/L～500 nmol/L)及退火溫度等主要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化分析，建立熒光定量PCR檢測方法。熒光定量PCR反應(yīng)過程中選取多通道掃描模式，反應(yīng)結(jié)束后分別選擇ROX、CY5和FAM通道進(jìn)行結(jié)果分析，通過各S型擴(kuò)增曲線來確定待測樣品中HEV的基因型。

1.5 特異性試驗(yàn)分別以提取的甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、皰疹病毒、豬瘟病毒、流行性腹瀉病毒等基因組核酸和不同型HEV陽性RNA為模板，利用已優(yōu)化的多重?zé)晒舛縋CR條件進(jìn)行擴(kuò)增，并設(shè)立無模板的陰性對照，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.6 敏感性試驗(yàn)將不同型HEV標(biāo)準(zhǔn)陽性RNA 10倍倍比稀釋至 1.5×106拷貝 /μL～1.5×101拷貝 /μL后作為模板，按照建立的多重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行檢測，每個(gè)稀釋度10個(gè)重復(fù)，分析該方法的敏感性。不同型HEV的最低檢測限(LOD)定義為10個(gè)重復(fù)均能檢出的最低拷貝數(shù)。

同時(shí)，將不同型HEV陽性RNA 10倍倍比稀釋后兩兩混合，按棋盤滴定方法進(jìn)行檢測，用以分析多重?zé)晒舛縋CR體系在不同RNA模板存在的情況下對另一型HEV RNA的最低檢測限的影響。試驗(yàn)分析中加入 EGFP RNA(2×104拷貝 /反應(yīng)管)作為質(zhì)控。

1.7 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)將不同基因型HEV標(biāo)準(zhǔn)陽性RNA分別進(jìn)行4次檢測，每次試驗(yàn)時(shí)將陽性標(biāo)準(zhǔn) RNA 倍比稀釋至 1.5×106～1.5×101拷貝 /μL，每個(gè)稀釋度設(shè)置4個(gè)重復(fù)，計(jì)算不同型HEV各稀釋度平均Ct值及4次獨(dú)立試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差，以評估該方法的重復(fù)性。

1.8 臨床樣品檢測按照試劑盒說明提取人血清樣本、豬血清樣本和處理的豬糞便樣品中RNA，以其為模板，利用建立的多重?zé)晒舛縋CR方法檢測。同時(shí)利用套式PCR方法[3]檢測上述樣品，對二者實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用R-software計(jì)算重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)的平均Ct值和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)等對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果對反應(yīng)體系各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果顯示HEV擴(kuò)增引物濃度(HEV-uni-F/HEV-uni-R)為 800 nmol/L、特異性探針HEV-1-ROX、HEV-3-CY5和 HEV-4-FAM濃度分別為200 nmol/L以及退火溫度為60℃時(shí)，多重?zé)晒舛?PCR體系對 HEV1、HEV3和 HEV4均有很高的擴(kuò)增效率，且不同型HEV的擴(kuò)增效率基本一致(圖1)。同時(shí)，在保證質(zhì)控反應(yīng)效率的基礎(chǔ)上，確定多重?zé)晒舛縋CR體系中EGFP擴(kuò)增引物和探針濃度為200 nmol/L和100 nmol/L，從而盡量減少了EGFP質(zhì)控反應(yīng)體系對HEV RT-PCR的影響。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果采用建立的多重?zé)晒舛縋CR方法對甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、皰疹病毒、豬瘟病毒、流行性腹瀉病等核酸及HEV陽性RNA進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，ROX通道僅HEV1出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其余病原及陰性對照均無擴(kuò)增(圖2)，此外，CY5和FAM通道也分別僅有HEV3和HEV4陽性RNA出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(圖略)，表明所建立的方法具有良好的特異性。

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果由于多重?zé)晒舛縋CR體系不能從所有的10個(gè)重復(fù)反應(yīng)管中檢出5個(gè)拷貝的陽性HEV RNA，因此多重體系對HEV 1、HEV3和HEV 4的最低檢測限(LOD)均為50個(gè)拷貝/反應(yīng)(圖3、表2)，且多重體系對不同型HEV的檢測靈敏度不受體系中EGFP質(zhì)控反應(yīng)的影響。

為進(jìn)一步分析不同型HEV擴(kuò)增反應(yīng)間的互相干擾，將HEV陽性RNA倍比稀釋后兩兩混合，按棋盤滴定方法進(jìn)行組合反應(yīng)。結(jié)果顯示，在多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系中，不同濃度HEV RNA不干擾另一基因型HEV基因組的高效擴(kuò)增，其檢測限也未受影響(部分結(jié)果見圖4)。

圖1 多重?zé)晒舛縋CR方法對不同型HEV RNA擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增效率Fig.1 Standard curves for the real time PCR based on 10-fold dilution series of positive HEV RNA

圖2 多重?zé)晒舛縋CR檢測方法特異性分析(ROX通道)Fig.2 The specificitytest of the multiplex qPCR(ROX)

2.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果對倍比稀釋的不同型HEV陽性標(biāo)準(zhǔn)RNA按多重?zé)晒舛縋CR分別進(jìn)行10個(gè)重復(fù)檢測，不同拷貝數(shù) HEV1、HEV3和HEV4反應(yīng)的Ct值標(biāo)準(zhǔn)差分別在 0.69～1.22、0.33～0.72和 0.46～0.81，變異系數(shù)均低于 4%(表 3)。此外，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的不同拷貝數(shù)HEV的重復(fù)管間實(shí)際檢測基因組拷貝數(shù)無顯著性差異(表3)，表明多重?zé)晒舛縋CR具有很高的重復(fù)性。

多重?zé)晒舛縋CR方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)分析結(jié)果顯示，該方法對HEV1、HEV3和HEV4具有良好的檢測穩(wěn)定性，其不同批次間檢測Ct值標(biāo)準(zhǔn)差分別僅為 0.32～1.56、0.21～0.93 和 0.45～0.73(圖 5)。表明該方法穩(wěn)定性良好。

圖3 多重?zé)晒舛縋CR檢測敏感性分析(FAM通道)Fig.3 The sensitivity of the multiplex qPCR(FAM)

表2 不同型HEV的最低檢測限Table 2 The sensitivity and reproducibility of the multiplex qRT-PCR

2.5 臨床樣品檢測結(jié)果分別利用HEV多重?zé)晒舛縋CR和套式PCR[3]對采集的臨床樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示HEV多重?zé)晒舛縋CR體系從豬糞便樣品中檢出陽性樣品13份，其中10份為HEV4、3份為HEV3；豬血清和人血清中則分別檢出3份和1份HEV4陽性，檢測結(jié)果與套式PCR結(jié)果一致(表4)，表明多重?zé)晒舛縋CR體系對于臨床樣品的檢測具有很高的準(zhǔn)確性。

圖4 多重?zé)晒舛縋CR體系中不同型HEV擴(kuò)增效率和檢測限受異源基因組的干擾性分析Fig.4 Checkerboard titration of HEV1,HEV3 and HEV4 assay

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Reproducibility of the multiplex RT-qPCR

3 討論

HEV宿主范圍廣，動(dòng)物自然宿主與人類HEV感染有密切關(guān)系，豬則是重要的HEV動(dòng)物宿主。豬HEV不僅在形態(tài)、結(jié)構(gòu)上與人HEV相似，而且基因結(jié)構(gòu)也相似，序列同源性可在90%以上[12]。豬HEV在遺傳進(jìn)化上并不構(gòu)成獨(dú)立分支，而是與同一地區(qū)的人源HEV株共屬同一分支[13]。已有報(bào)道證實(shí)HEV可能在自然狀態(tài)下或通過食物等在動(dòng)物和人之間傳播[14-15]。因此，HEV在公共衛(wèi)生和食品安全方面具有重要意義。

圖5 多重?zé)晒舛縋CR穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Repeatability test of the multiplex assay

表4 臨床樣品檢測結(jié)果Table 4 Detection of swine feces and sera samples with the multiplex real-time PCR and single real-time PCR

目前已有RT-PCR和熒光定量RT-PCR方法用于HEV感染檢測的報(bào)道，但能達(dá)到同時(shí)檢測并能鑒別不同型HEV感染的方法還未見報(bào)道[10]。研究顯示，在同一區(qū)域、同一群體甚至同一個(gè)體中均可能存在不同基因型HEV的共感染，并可通過基因重組等方式產(chǎn)生新的HEV，目前的血清學(xué)診斷技術(shù)難以對不同基因型感染進(jìn)行鑒別[16]。本研究中的HEV通用引物為HEV基因組保守序列，能與HEV1、HEV3和HEV4 3種基因型ORF3基因序列結(jié)合而擴(kuò)增，3條型特異性探針則分別針對HEV1、HEV3和HEV4 ORF3基因序列中的特異性區(qū)域設(shè)計(jì)，從而達(dá)到有效鑒別不同HEV基因型的目的。通過對引物、探針濃度退火和溫度等的優(yōu)化，建立了一步法HEV多重?zé)晒釶CR鑒別體系，其最低檢測限與傳統(tǒng)套式RT-PCR方法[5]相當(dāng)，但傳統(tǒng)套式RT-PCR方法包含反轉(zhuǎn)錄、第一輪PCR和第二輪PCR三步，耗時(shí)至少需3 h，出現(xiàn)陽性擴(kuò)增后還需更長時(shí)間的測序來確定基因型，且在反轉(zhuǎn)錄以及兩輪PCR加樣過程中極易造成交叉污染。而本研究的一步法多重RT-PCR方法實(shí)現(xiàn)快速閉管且能分型鑒定，耗時(shí)極大縮短，且具有更高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。同時(shí)，引入EGFP基因質(zhì)控，可有效對核酸提取、反轉(zhuǎn)錄過程等影響多重?zé)晒舛縋CR體系檢測質(zhì)量和效率等的因素進(jìn)行監(jiān)控，從而保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確有效。對臨床樣本的檢測結(jié)果表明了該多重?zé)晒舛縋CR方法可以用于臨床HEV隱性感染或早期感染的快速診斷，為該病的有效防制提供方法。