肺炎克雷伯菌ST23流行株皮膚膿腫感染及肥大細胞動態(tài)變化觀察

雷志強，劉冰靨， 張 丁，魯波勇，韓 莉，王德成,6*

(1.三峽大學 醫(yī)學院，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學 感染與炎癥損傷研究所，湖北 宜昌 443002；3.武穴市第一人民醫(yī)院，湖北 武穴 435400；4.三峽大學 第一臨床醫(yī)學院 ＆ 宜昌市中心人民醫(yī)院病理科，湖北 宜昌 443003；5.宜昌市第三人民醫(yī)院，湖北 宜昌 443003；6.天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室(三峽大學)，湖北 宜昌 443002)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia，KP)廣泛分布于自然界，是主要定居在人和動物呼吸道、腸道等部位及環(huán)境中的一種重要機會致病菌，可以引起人和動物的多種感染。作為一種人獸共患病原菌，KP不僅是醫(yī)院與社區(qū)感染的重要致病菌之一，而且也能造成免疫功能低下或免疫抑制動物的各種炎癥，如肺炎、子宮炎、乳腺炎及其它化膿性炎癥，對養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失[1]。此外，楊帆等研究發(fā)現(xiàn)，從豬、雞、犬和兔子等動物分離的KP菌株有較強的生物膜形成能力，并且該生物膜與其毒力有關(guān)[2]。隨著廣譜抗菌素大量使用，KP耐藥菌株不斷增加，嚴重威脅人類健康和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展[3]。KP不僅可以引起呼吸系統(tǒng)感染，還可導致各種外周組織感染，如手術(shù)感染、外傷及皮膚感染[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)KP引起的皮膚感染率比較高，Saaiq等報道巴基斯坦醫(yī)學院燒傷中心細菌感染病例中KP感染率為20.58%，位居第二[6]。前期通過收集臨床醫(yī)院的KP菌株，并進行MLST分型，鑒定到該菌ST23型是宜昌地區(qū)的主要流行菌株[7]。為研究ST23菌株對皮膚的感染能力及其導致的皮膚膿腫過程中肥大細胞及其主要介質(zhì)的動態(tài)變化，為全面認識本地區(qū)ST23型KP菌株導致的皮膚感染提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料濃度為 1×109cfu/100 μL或5×108cfu/50 μL的KP ST23型菌株由本實驗室分離并保存。甲苯胺藍購自Sigma公司；抗肥大細胞類胰蛋白酶(Tryptase)一抗(ab2378)購自Abcam公司；HRP標記的羊抗鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。SPF級C57BL/6小鼠由三峽大學實驗動物中心提供；MyD88KO小鼠購自南京大學模式動物研究所。

1.2 動物分組及感染實驗將60只SPF級C57BL/6小鼠隨機分為 3組：PBS對照組(20只)、KP常規(guī)感染組(20只)和免疫抑制 KP感染組(20只)，20只MyD88KO小鼠接種KP作為免疫功能缺失感染組。所有C57BL/6和MyD88小鼠又分為兩個小組(10只/組)：其中一個小組用于接種后膿腫體積變化觀察，另一小組用于接種后1 d、5 d和10 d的皮膚采樣。免疫抑制KP感染組小鼠在KP感染前3 d按體質(zhì)量20 mg/kg連續(xù)注射環(huán)磷酰胺，然后再接種KP。所有小鼠均預(yù)飼養(yǎng)3 d后在其右側(cè)腹部皮下脫毛處理，再飼養(yǎng)5 d后進行后續(xù)實驗。對照組小鼠皮下接種50 μL無菌PBS，而所有感染組小鼠均接種 50 μL KP 菌液(5×108cfu/小鼠)。接種后每天觀察小鼠兩次，主要觀察接種處皮膚變化，并做好記錄。實驗過程中供給專用飼料及飲水，并遵循實驗動物的 3R(Reduction、Replacement、Refinement、3R)原則給予人道關(guān)懷。

1.3 感染后小鼠皮膚膿腫的組織病理學變化對KP感染組和PBS對照組小鼠各隨機選取10只，觀察并記錄膿腫部位皮膚顏色變化、是否有潰瘍和結(jié)痂等狀況，并做好詳細記錄。每天兩次，分別用游標卡尺測定膿腫的長徑與寬徑，按照公式[V=(π/6)L·W2]計算膿腫體積(L-膿腫長徑，W-膿腫寬徑)，直至實驗結(jié)束。

各組剩余10只小鼠在接種后1 d、5 d和 10 d時，分別隨機取3只小鼠斷頸迫殺，取膿腫處皮膚置于4%多聚甲醛溶液固定。常規(guī)包埋切片后進行H.E染色，比較各組小鼠皮膚病理組織學變化。

1.4 感染后小鼠肥大細胞及其主要介質(zhì)的動態(tài)變化與觀察參照文獻[8]中改進的甲苯胺藍染色方法，對上述皮膚組織制備5 μm鏡檢切片，顯微鏡下觀察不同組別小鼠肥大細胞的分布與形態(tài)，并分別計數(shù)肥大細胞數(shù)量。

以抗肥大細胞 Tryptase抗體為一抗(1∶200)，羊抗鼠HRP-IgG為二抗(商業(yè)化Kit不需要稀釋，直接使用)，進行免疫組化試驗。利用cellSens Entry圖像分析軟件采集照片，進行IPP圖像分析。每張切片隨機選擇10個視野，分析每個視野中Tryptase含量(面密度)，以Tryptase表達陽性區(qū)域占全視野面積的百分比表示，取其平均值，分別統(tǒng)計不同組別中Tryptase陽性物質(zhì)表達與分布變化。

1.5 數(shù)據(jù)處理使用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，采用析因設(shè)計進行方差分析，兩組數(shù)據(jù)之間的差異采用q檢驗，p＜0.05為組間比較差異顯著，認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 感染后小鼠皮膚膿腫體積變化所有接種KP的小鼠在感染第1 d時，皮膚出現(xiàn)紅腫，隨著感染時間延長，感染處膿腫也發(fā)生有規(guī)律的變化，在感染后5 d時，部分小鼠感染處皮膚開始出現(xiàn)潰瘍和破潰；到第10 d時，有些小鼠潰瘍處的皮膚開始結(jié)痂，呈現(xiàn)自動愈合過程。尤其是MyD88KO小鼠感染KP后有明顯的皮膚膿腫形成。在整個實驗過程中，所有感染KP小鼠的皮膚膿腫體積與PBS對照組相比差異極顯著(p＜0.001)，免疫抑制感染組小鼠皮膚膿腫體積和常規(guī)感染組相比差異顯著(p＜0.01)。所有KP感染組小鼠的皮膚膿腫體積均呈現(xiàn)動態(tài)變化規(guī)律，在感染早期呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，后期逐步降低(圖 1)，并且體積變化與膿腫的動態(tài)發(fā)展過程相一致。表明KP ST23型菌株能夠造成皮膚感染。

圖1 各組小鼠皮膚膿腫體積變化曲線Fig.1 The dynamics of skin abscess in KP-infected mice during the experimental period

2.2 感染后小鼠皮膚組織病理學變化分別于接種后1 d、5 d和10 d時觀察小鼠感染處皮膚組織，顯示在不同時間點PBS組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)均較完整，顯微鏡下無炎性細胞浸潤(圖2A、2E)；常規(guī)KP感染組小鼠有較明顯的皮膚組織病理變化，感染后1 d時皮下區(qū)域有明顯可見的炎性細胞分布，第5 d時皮膚纖維結(jié)構(gòu)破壞(圖 2B、2F)；免疫抑制組感染KP后皮膚炎癥反應(yīng)明顯(圖2D、2H)；MyD88KO組小鼠感染KP后第1d炎性細胞浸潤不明顯，第5 d時表皮細胞層遭到不同程度的破壞，結(jié)構(gòu)模糊不清，真皮乳頭層內(nèi)的皮脂腺結(jié)構(gòu)完全遭到破壞，皮下組織炎癥區(qū)域大量炎癥細胞浸潤。真皮膠原結(jié)構(gòu)遭到不同程度的破壞，凝聚成片狀或條索狀，在其中有大量炎性細胞浸潤(圖2C、2G)。表明本研究中的KP ST23型菌株能夠造成小鼠的皮膚炎癥，尤其是對環(huán)磷酰胺造成的免疫功能抑制小鼠及免疫功能缺陷的MyD88KO小鼠具有較強的皮膚損傷。

圖2 各組小鼠皮膚組織病理變化觀察(HE染色)Fig.2 Histopathologic examination of the skin in mice after infection with KP

2.3 感染后小鼠皮膚肥大細胞觀察采集各組小鼠皮膚組織，甲苯胺藍染色后觀察肥大細胞。結(jié)果顯示，對照組小鼠接種PBS后1 d與5 d時小鼠皮膚組織中肥大細胞很少且形態(tài)較小，并且主要分布在表皮層區(qū)域(圖3A、3 E)；常規(guī)感染組小鼠接種KP 1 d和5 d后皮膚表皮層與真皮層均可見肥大細胞分布(圖 3B、3F)；MyD88KO組小鼠接種KP 1 d和 5 d時可見其表皮層與真皮層均有大量肥大細胞分布(3C、3G)；免疫抑制組小鼠感染KP 1 d和5 d時可見大量的肥大細胞彌散分布表皮和真皮層(3D、3H)。對不同組感染 KP后 1 d、5 d和 10 d小鼠皮膚肥大細胞的數(shù)量統(tǒng)計顯示，與PBS對照組相比，KP各感染組小鼠肥大細胞數(shù)量均差異顯著(p＜0.001)。整個實驗周期內(nèi)，除了PBS對照組，隨著感染時間延長，接種KP菌株的各組小鼠皮膚組織中肥大細胞數(shù)量均明顯增加，但各感染組小鼠之間肥大細胞無顯著差異(3I)。接種KP后5 d時各組小鼠肥大細胞數(shù)目達到峰值，而后呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，表明KP ST23型菌株能夠誘導小鼠皮膚組織中肥大細胞的活化。

2.4 感染后小鼠皮膚Tryptase的表達變化采集各組小鼠皮膚組織進行免疫組化檢測其Tryptase的表達。結(jié)果顯示，PBS對照組小鼠皮膚中幾乎檢測不到tryptase(圖4A)，而各KP感染組小鼠皮膚組織中均能檢測到tryptase的表達與分布，尤其是炎癥區(qū)域中明顯可見，且在皮膚各層結(jié)構(gòu)中均檢測到tryptase陽性信號(圖4B～圖4D)。Tryptase陽性物質(zhì)面密度統(tǒng)計分析顯示，整個實驗周期內(nèi)，各KP感染組小鼠皮膚中tryptase的表達均呈明顯增加趨勢，與 PBS對照組相比差異顯著(圖 4E，p＜0.001)，但其余感染組之間無顯著差異。各感染組小鼠在感染KP 5 d時tryptase的表達達到峰值，然后逐漸降低。表明KP感染后能夠誘導小鼠皮膚組織中Tryptase的活化，并且Tryptase的表達呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。

圖3 各組小鼠皮膚肥大細胞動態(tài)分布與數(shù)量統(tǒng)計Fig.3 Dynamics of mast cells during the skin abscess in mice

圖4 Tryptase在各組小鼠皮膚中的表達分布與統(tǒng)計分析Fig.4 Expression and dynamics of tryptase in the skin abscess of mice

3 討論

KP可以通過皮膚接觸傳染，因此容易造成皮膚受傷后的術(shù)后感染或皮膚感染形成膿腫[4,6,9-10]。Guo等發(fā)現(xiàn)ST23型是溫州地區(qū)臨床KP的主要流行克隆[11]。Siu等通過收集臨床分離克雷伯菌株并經(jīng)MLST分型，顯示ST23型是香港、臺灣和新加坡等地區(qū)的主要流行株，進一步研究顯示相對非ST23型菌株，ST23型菌株具有較強的抗吞噬效應(yīng)和對小鼠的致死能力[12]。本研究顯示ST23菌株能夠?qū)е滦∈笃つw膿腫形成，主要表現(xiàn)為小鼠表皮或真皮層有明顯可見的炎性細胞浸潤，正常結(jié)構(gòu)破壞。本研究結(jié)果表明本地區(qū)ST23型菌株具有較強的致病性。

MyD88是 Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)信號通路中重要的接頭蛋白，van Lieshout和Cai等團隊分別研究發(fā)現(xiàn)MyD88對宿主抗克雷伯菌感染至關(guān)重要[13-14]，MyD88KO小鼠感染克雷伯菌后易死亡，且機體清除細菌的能力顯著降低。Feuerstein等發(fā)現(xiàn)真皮層巨噬細胞MyD88分子在宿主抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)過程中能快速傳遞信號[15]。本研究顯示相較于正常C57BL/6小鼠，MyD88KO小鼠感染KP后形成膿腫的體積較大，皮膚膿腫自愈時間較晚，并且該表型小鼠與用環(huán)磷酰胺預(yù)處理的小鼠類似。

肥大細胞廣泛分布于皮膚、呼吸道等組織中，在抗皮膚感染等中發(fā)揮重要作用[16]，但KP皮膚感染及膿腫形成過程中肥大細胞動態(tài)變化的研究少有報道。本研究中與PBS對照組相比，各KP感染組小鼠中肥大細胞數(shù)量明顯增加，并且部分表現(xiàn)為脫顆粒狀態(tài)，提示肥大細胞在KP介導膿腫形成過程中激活并釋放介質(zhì)參與發(fā)病進程。但統(tǒng)計結(jié)果顯示在各KP感染組小鼠之間肥大細胞數(shù)目與Tryptase表達無明顯差異，表明ST23型菌株對免疫抑制或免疫缺陷動物造成的皮膚損傷效應(yīng)可能還依賴于其它通路或關(guān)鍵分子。

Tryptase為肥大細胞激活的標志[8,17]，本研究結(jié)合免疫組化染色與圖像分析技術(shù)，比較了Tryptase在PBS對照組與各KP感染組中的表達與變化趨勢，結(jié)果顯示在KP感染早期，Tryptase表達逐漸增加，在第感染KP第5 d時表達量最高，然后逐漸降低，其表達量與肥大細胞變化趨勢相一致，表明KP感染后能夠誘導Tryptase表達。Lei等通過ST239型MRSA菌株建立小鼠皮膚感染模型，結(jié)果顯示隨著感染時間延長，小鼠感染處皮膚組織有明顯活化的肥大細胞并能釋放 Tryptase[16]。Hodille等通過細胞模型研究MRSA誘導肥大細胞活性時，顯示MRSA菌株的delta-溶血素(Hld)和酚可溶性調(diào)節(jié)肽 (Phenol soluble modulins，PSMs)等可通過劑量依賴方式誘導HMC-1人肥大細胞釋放類蛋白酶[18]。本實驗再次印證了以上研究結(jié)果。表明ST23型KP菌株能夠誘導小鼠皮膚組織釋放Tryptase參與到皮膚炎癥反應(yīng)和組織損傷過程，但其具體機制還有待深入研究。

本研究利用ST23型KP流行株皮下接種SPF級C57BL/6小鼠，對皮膚膿腫形成過程進行了時相性觀察，記錄其皮膚膿腫體積變化，并進一步比較了其皮膚組織病理學變化。本研究結(jié)果穩(wěn)定、再現(xiàn)性好、為進一步研究KP臨床分離株的病原特性、致病機制等小動物感染模型提供依據(jù)。另外由于ST23型KP是在宜昌地區(qū)首次分離鑒定，提示該型細菌在該地區(qū)具有重要臨床意義。