雞白痢沙門菌cpxR基因缺失株的構(gòu)建及體外應(yīng)激試驗(yàn)

吳同壘，于秀劍，黃翠琴，張志強(qiáng)，李佩國*，朱國強(qiáng)

(1.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島 066004；3.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，福建龍巖 364000)

雞白痢是由沙門菌中的雞白痢沙門菌(S.pullorum)引起的一種全身性疾病，能夠引起雛雞的大規(guī)模死亡，成年雞感染后癥狀不明顯，有時(shí)僅表現(xiàn)為體重和產(chǎn)蛋率下降[1]。雞白痢能夠水平傳播，也能垂直傳播給雛雞，這是其難以凈化的關(guān)鍵所在，在我國該病依然是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的傳染病之一[2-3]。

雞白痢沙門菌主要以糞-口途徑傳播，細(xì)菌經(jīng)過口腔、胃、最后吸附于小腸上皮，在小腸上皮細(xì)胞內(nèi)定植，并逐漸擴(kuò)散至肝臟、卵巢等器官，引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，造成雛雞大量死亡和成雞的生產(chǎn)性能下降[4]。細(xì)菌要完成這一感染過程，必須能夠抵御胃腸道和細(xì)胞內(nèi)的不良環(huán)境應(yīng)激。CpxR/A系統(tǒng)是多數(shù)革蘭氏陰性菌重要的雙組分調(diào)控系統(tǒng)，它由一個(gè)跨內(nèi)膜的組氨酸蛋白激酶CpxA和位于細(xì)胞質(zhì)的響應(yīng)調(diào)控蛋白CpxR組成[5]。有研究表明，CpxR/A系統(tǒng)在細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境應(yīng)激過程中意義重大。本研究對白痢沙門菌CpxR進(jìn)行外源表達(dá)，并制備其抗血清，利用λ-Red同源重組技術(shù)對cpxR進(jìn)行了基因敲除，并進(jìn)行體外應(yīng)激試驗(yàn)和慶大霉素保護(hù)試驗(yàn)，以闡明雞白痢沙門菌雙組份系統(tǒng)CpxR/A的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑鼠源巨噬細(xì)胞Raw264.7由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)單曉楓教授惠贈(zèng)；6周齡～8周齡SPF級BALB/c雌鼠，購自北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司(北京)。TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司；T4連接酶、限制性內(nèi)切酶和蛋白質(zhì)Marker均購自 Fermentas公司；L-阿拉伯糖購自Sigma公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購自康為試劑生物技術(shù)有限公司；ATB自動(dòng)鑒定系統(tǒng)及ID32E生化鑒定試紙條購自Biomerieux公司；CpxR鼠源多克隆抗體(CpxR-PcAb)由河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物傳染病研究室保存；羊抗鼠HRP-IgG購自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司。

1.2 菌株和質(zhì)粒雞白痢沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19945由吉林商檢王偉利研究員惠贈(zèng)；質(zhì)粒pKD3、pKD46、pCP20、pBBR322由揚(yáng)州大學(xué)朱國強(qiáng)教授惠贈(zèng)。

1.3 λ-Red同源重組引物的設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI登錄的雞白痢沙門菌基因組序列(CP012347.1)，利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物。

引物P1和P2由兩部分組成，5'端(有下劃線部分)與cpxR基因序列同源，3'端與質(zhì)粒 pKD3氯霉素抗性基因同源，該對引物用于擴(kuò)增cat基因。引物 P3、P4用于擴(kuò)增cpxR基因開放閱讀框(ORF)，構(gòu)建cpxR基因回補(bǔ)菌株。引物P5、P6位于cpxR基因ORF外側(cè)，用于cpxR基因缺失菌株的鑒定。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

表1 引物信息Table 1 Primers designed for target genes

1.4 雞白痢沙門菌cpxR基因缺失株及回補(bǔ)菌株的構(gòu)建以質(zhì)粒pKD4為模板，使用引物P1/P2擴(kuò)增打靶片段；挑取雞白痢沙門菌ATCC 19945(攜帶pKD46)單菌落，在 LB(含 Amp 100 μg/μL)中培養(yǎng)至對數(shù)期，加入阿拉伯糖(終濃度30 mmol/L)誘導(dǎo)2 h。取出培養(yǎng)后的菌液冰上放置10 min后，使用冰冷的去離子水重懸3次，制備感受態(tài)細(xì)胞。將打靶片段電轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，涂布氯霉素平板，培養(yǎng)24 h后挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。42℃熱激去除質(zhì)粒pKD4，得到一次重組菌株ATCC19945::cat。挑取單菌落搖菌至對數(shù)期，冰冷的去離子水重懸，制備感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pCP20，消除氯霉素抗性標(biāo)記，最終得到缺失cpxR基因的二次重組菌株ATCC19945ΔcpxR，采用引物 P5/P6對其進(jìn)行 PCR鑒定。

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取雞白痢沙門菌基因組DNA，作為模板，利用P3/P4引物擴(kuò)增cpxR基因片段，將其克隆至pBR322質(zhì)粒中，構(gòu)建pBR322-cpxR，電轉(zhuǎn)化至菌株 ATCC19945ΔcpxR中，構(gòu)建回補(bǔ)菌株ATCC19945ΔcpxR+cpxR。

得到的菌株 ATCC19945ΔcpxR和 ATCC19945 ΔcpxR+cpxR，使用CpxR-PcAb作為一抗，以羊抗鼠HRP-IgG作為二抗，western blot鑒定基因缺失菌株和回補(bǔ)菌株cpxR基因的表達(dá)情況。

1.5 重組菌生長曲線和生化特性的測定挑取ATCC19945、ATCC19945ΔcpxR和 ATCC19945ΔcpxR+cpxR單菌落接種LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日按1∶50轉(zhuǎn)接新鮮LB，37℃震蕩培養(yǎng)；每隔 2 h測定一次菌液OD600nm，繪制3種菌的生長曲線。采用ATB自動(dòng)鑒定系統(tǒng)對ATCC19945、ATCC19945ΔcpxR和ATCC19945ΔcpxR+cpxR進(jìn)行生化特征的鑒定。

1.6 重組菌胞內(nèi)存活能力的測定取生長良好的Raw264.7巨噬細(xì)胞接種24孔細(xì)胞板；將培養(yǎng)至對數(shù) 生 長 期 的 ATCC19945、ATCC19945ΔcpxR和ATCC19945ΔcpxR+cpxR細(xì)菌計(jì)數(shù)。按照 MOI=10的劑量將3種細(xì)菌分別加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，孵育1 h后置換為含 20 μg/mL慶大霉素的 DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，以殺死細(xì)胞外的細(xì)菌。取不同感染時(shí)間點(diǎn)(2 h、6 h、10 h、24 h)裂解細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用Prism 5.0軟件分析。

1.7 重組菌的應(yīng)激試驗(yàn)將培養(yǎng)至對數(shù)期的ATCC19945、ATCC19945ΔcpxR和 ATCC19945ΔcpxR+cpxR分別使用pH3.5和pH10.0的滅菌生理鹽水，37℃ 孵育30 min，測試重組菌對酸、堿的應(yīng)激；測試上述菌在42℃，生理鹽水中孵育10 min的熱應(yīng)激；測試上述菌在含10 mmoL/L H2O2的生理鹽水，37℃孵育10 min的氧化應(yīng)激。測試完成后倍比稀釋進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Prism 5.0軟件。

1.8 重組菌的抗蛋清殺傷試驗(yàn)取4～6枚雞蛋表面消毒后，無菌吸取蛋清。將培養(yǎng)至對數(shù)期的ATCC19945、ATCC19945ΔcpxR和 ATCC19945ΔcpxR+cpxRPBS重懸并稀釋至 1×104cfu/mL后，取菌液加入等體積蛋清液中充分混勻，37℃孵育。在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)菌存活率(不同時(shí)間點(diǎn)的活菌數(shù)與初始活菌數(shù)之比)。

2 結(jié)果

2.1 ATCC19945ΔcpxR基因缺失株與回補(bǔ)株的構(gòu)建及鑒定PCR擴(kuò)增含有cpxR基因同源序列和氯霉素基因的打靶片段，電轉(zhuǎn)化至雞白痢沙門菌ATCC19945感受態(tài)細(xì)胞中，得到一次重組菌株ATCC19945::cat；利用質(zhì)粒pCP20消除氯霉素片段，得到二次重組菌株 ATCC19945ΔcpxR。利用質(zhì)粒pBBR322，構(gòu)建回補(bǔ)菌株 ATCC19945ΔcpxR+cpxR。經(jīng)過PCR驗(yàn)證，獲得了一次重組菌株ATCC19945::cat和二次重組菌株 ATCC19945ΔcpxR(圖 1A)。為了進(jìn)一步確認(rèn)cpxR基因的敲除，利用鼠源抗CpxRPcAb進(jìn)行western blot分析，結(jié)果顯示cpxR基因在缺失菌株中沒有表達(dá)，在回補(bǔ)菌株中獲得了表達(dá)(圖1B)。表明，獲得了cpxR基因敲除菌株和其回補(bǔ)菌株。

圖1 雞白痢沙門菌cpxR基因缺失株ATCC19945ΔcpxR的鑒定Fig.1 Identifiation of cpxR-deletion strain of S.pullorum

2.2 重組菌的生化特性分析和生長曲線繪制利用ATB全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)對ATCC19945、ATCC19945 ΔcpxR和ATCC19945ΔcpxR+cpxR的生化反應(yīng)譜進(jìn)行測定。結(jié)果顯示：3株菌之間生化反應(yīng)譜無區(qū)別，表明cpxR基因缺失并不影響雞白痢沙門菌生化特性。菌株 ATCC19945、ATCC19945ΔcpxR和 ATCC19945 ΔcpxR+cpxR的生長曲線結(jié)果顯示，在LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)條件下，3株細(xì)菌的生長速度無明顯差異(p＜0.01)(圖 2)。表明，cpxR基因缺失并未造成雞白痢沙門菌的營養(yǎng)缺陷。

圖2 各菌株生長曲線測定Fig.2 Growth curve determination of the S.pullorum strains

2.3 cpxR基因缺失對白痢沙門菌胞內(nèi)存活的影響取 ATCC19945、 ATCC19945ΔcpxR和 ATCC19945ΔcpxR+cpxR菌液，以MOI=10的劑量感染鼠源巨噬細(xì)胞系Raw264.7，測定其胞內(nèi)存活能力。結(jié)果顯示，在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，3種菌的活菌數(shù)無明顯差異(p＞0.05)(圖 3)。結(jié)果表明，在細(xì)胞水平上cpxR基因?qū)﹄u白痢沙門菌的胞內(nèi)存活能力沒有明顯的影響。

圖3 各菌株的胞內(nèi)存活試驗(yàn)Fig.3 Intracellular survival test of the S.pullorum strains

2.4 cpxR基因缺失對白痢沙門菌抗應(yīng)激能力的影響體外應(yīng)激試驗(yàn)檢測菌株ATCC19945、ATCC19945 ΔcpxR和ATCC19945ΔcpxR+cpxR對酸、堿、熱和氧化應(yīng)激的抵抗能力。結(jié)果顯示，cpxR基因缺失株在應(yīng)激條件下其存活菌數(shù)均低于野生型菌株(p＜0.01)，抗應(yīng)激能力減弱，回補(bǔ)菌株則恢復(fù)了抗應(yīng)激能力(圖4)。表明CpxR參與白痢沙門菌對環(huán)境應(yīng)激的抵抗。

圖4 環(huán)境應(yīng)激對cpxR基因缺失株生長的影響Fig.4 Effects of environmental stress on the growth of cpxR gene-knockout strain

2.5 重組菌的抗蛋清殺傷試驗(yàn)將菌株ATCC19945、ATCC19945ΔcpxR和 ATCC19945ΔcpxR+cpxR與蛋清混合孵育后，通過活菌計(jì)數(shù)法算出各細(xì)菌存活率。結(jié)果顯示，蛋清對白痢沙門菌有一定的殺傷作用，菌株ATCC19945ΔcpxR存活率明顯低于 ATCC19945(p＜0.01)，回補(bǔ)菌株抗蛋清殺傷能力有所恢復(fù)(圖5)。 結(jié)果表明，CpxR參與雞白痢沙門菌對蛋清殺傷能力的抵抗。

圖5 cpxR基因缺失對ATCC19945菌株在蛋清中存活率的影響Fig.5 Survival rate of ATCC19945 related strains in egg albumen

3 討論

雞白痢由沙門菌中的雞白痢沙門菌引起，在我國，該病依然是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的傳染病之一[3]。沙門菌的致病性表現(xiàn)為對宿主細(xì)胞的侵襲能力和在細(xì)胞內(nèi)增殖的能力。經(jīng)食物和水源進(jìn)入消化道后，沙門菌要耐受胃腸道應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)的殺傷，實(shí)現(xiàn)在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖[6]。因此，雞白痢沙門菌需要抵御環(huán)境應(yīng)激的能力。研究表明，多種調(diào)控系統(tǒng)在其中發(fā)揮了重要作用，例如雙組分系統(tǒng)CpxR/A。嗜血桿菌、檸檬酸桿菌和阪崎腸桿菌等細(xì)菌的CpxR/A系統(tǒng)缺失菌株均發(fā)生了不同程度的毒力降低，表明該系統(tǒng)可能參與了對多種應(yīng)激條件的抵抗[7-11]。為了證明CpxR/A系統(tǒng)的重要作用，本研究利用λ-Red重組技術(shù)構(gòu)建了雞白痢沙門菌cpxR基因缺失菌株，進(jìn)行了各項(xiàng)應(yīng)激試驗(yàn)。結(jié)果顯示，cpxR基因參與了雞白痢沙門菌抵御熱、酸、堿和氧化應(yīng)激。利用鼠源巨噬細(xì)胞Raw264.7進(jìn)行體外細(xì)胞感染試驗(yàn)，結(jié)果顯示cpxR基因缺失株并未表現(xiàn)出明顯的毒力降低，這可能是由于體外試驗(yàn)并不能完全模擬體內(nèi)感染，雞白痢沙門菌在體內(nèi)遇到的不良環(huán)境復(fù)雜的多，因此簡單的體外細(xì)胞感染試驗(yàn)并不能顯示出細(xì)菌毒力的變化。同時(shí)，由于本研究采用的鼠源巨噬細(xì)胞，而沒有使用雞源巨噬細(xì)胞，這也可能是胞內(nèi)存活能力沒有明顯差異的一個(gè)原因。

在成年母雞體內(nèi)，雞白痢沙門菌能夠穿過卵巢進(jìn)入卵中，并能耐受蛋清中多種殺菌成分而存活下來，引起雛雞發(fā)病。在蛋清中，多種成分具有抑菌殺菌作用，一是蛋清中含有的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，可以大量螯合蛋清中的鐵離子，使得細(xì)菌難以獲得鐵；二是蛋清中的溶菌酶，可以溶解細(xì)菌；三是蛋清中的核酸內(nèi)切酶和外切酶，能夠破壞細(xì)菌的DNA，最終殺傷細(xì)菌[12-13]。耐受蛋清殺傷的能力是雞白痢沙門菌能夠垂直傳播的重要原因[14-15]。本研究顯示cpxR基因缺失后，雞白痢沙門菌在蛋清中的存活能力顯著降低，表明cpxR基因參與了雞白痢沙門菌對蛋清殺傷的抵抗，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

總之，cpxR基因參與了雞白痢沙門菌抵御環(huán)境應(yīng)激和蛋清殺傷，在不同環(huán)境應(yīng)激中，細(xì)菌的存活率降低，但是cpxR基因缺失株在鼠源巨噬細(xì)胞Raw264.7內(nèi)的增殖能力沒有發(fā)生改變。本研究通過cpxR基因敲除及應(yīng)激試驗(yàn)證明CpxR/A系統(tǒng)在雞白痢沙門菌抵御環(huán)境應(yīng)激中發(fā)揮了重要作用，但是其調(diào)控機(jī)制尚不明確，這將是本研究室下一步的研究重點(diǎn)。