美國國家家禽改良計劃標準程序（2014版）—血液檢測程序（2）

譯校│張倩 張淼潔 翟新驗（中國動物疫病預防控制中心）

5 判斷對禽群有雞毒支原體、滑液囊支原體和火雞支原體陽性反應狀態(tài)的程序（血液檢測程序1～4請見本刊2019年1期）

美國病理學家協(xié)會（AAAP）出版的《禽類病原體、禽類支原體?。u毒支原體）分離、鑒定和特性方法實驗室手冊》、世界動物衛(wèi)生組織2004年出版的第五版《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》，以及本標準程序記錄了分離和鑒定支原體的程序。

（a）確定禽群支原體感染狀態(tài)。應根據以下標準確定禽群的支原體感染狀態(tài)：

（1）如果酶聯免疫吸附測定（ELISA）、官方分子檢查程序或血清平板試驗結果呈陰性，則雞群符合陰性群的分類。

（2）如果酶聯免疫吸附測定或血清平板試驗結果呈陽性，則應進行紅細胞凝集抑制試驗或執(zhí)行分子檢查程序：若超過50%的樣本為雞毒支原體、火雞支原體或雞毒霉形體陽性，則進行紅細胞凝集抑制試驗時，應選擇10%的陽性樣本或25個陽性樣本進行試驗，以數量較大者為準。1∶40或更高比例的紅細胞凝集抑制效價可被解釋為可疑反應，應立即（從最初采樣算起7天內）從臨床檢測出受感染的30只家禽體內采集合適的抗原檢測標本，并用獲批的培養(yǎng)技術檢查每一只家禽，或用分子檢測程序或體內生物鑒定試驗進行混樣檢測（每一次的檢測量多達5個拭子）。

（3）如果體內生物鑒定、分子檢查程序或培養(yǎng)程序的結果呈陰性，則該禽群通過檢測，官方機構應認證其符合陰性群的分類。當培養(yǎng)液受到污染時，必須運用分子檢查技術做出最終裁定。

（4）如果體內生物鑒定、分子檢查程序或培養(yǎng)程序的結果呈陽性，則可認為該禽群已受到感染。

6 支原體標準檢測程序

血清平板凝集試驗和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是基本的支原體抗體篩選檢測試驗。選擇哪一種檢測取決于偏好、實驗室設施和可獲得的抗原。盡管這兩種檢測都相當準確，但由于偶然存在非特異性反應，這些檢測只能測定禽群的狀態(tài)，而不能測定單獨某只禽的狀態(tài)。在正常情況下，發(fā)生這種非特異性反應的概率很低，尤其是在火雞身上使用了丹毒菌苗以后，用支原體抗體檢測密切相關的支原體的偶爾非特異性反應的發(fā)生率會很高。就常規(guī)篩查而言，紅細胞凝集抑制試驗陽性反應非常準確，但有些過于煩瑣，只在評價與酶聯免疫吸附試驗和平皿抗原起反應的血清標本時有幫助。應以4個紅細胞凝集單位為標準進行檢測。當雞和火雞血清的效價為1∶80或更高時，結果為陽性；為1∶40時，結果為可疑，則需要進行額外的檢測。

（a）血清平板凝集試驗。用來檢測支原體的血清平板凝集試驗應按照《國家家禽改良計劃》（NPIP）批準的生產商的指示進行，每檢測一個樣本時，都應根據已知的陽性和陰性對照血清來測試抗原。可從國家獸醫(yī)服務實驗室（NVSL）獲得陰性和陽性血清。另外還可以通過商業(yè)途徑購買到陽性和陰性質控血清。

（b）紅細胞凝集抑制試驗。支原體紅細胞凝集抑制反應試驗通過抗原量不變，血清量降低的方法進行。該方法需要用到4個紅細胞凝集單位的稀釋抗原。用到的紅細胞凝集單位數目的變化會顯著地改變陽性血清效價。針對雞毒支原體、滑液囊支原體和火雞支原體的標準紅細胞凝集抗原可從國家獸醫(yī)服務實驗室獲得。該抗原已按照1∶640的比例進行滴定和稀釋。在首次使用或長時間儲存后，應按照段落（b）（2）（ii）或（b）（3）（ii）中所述的方法檢查每一個樣本的紅細胞凝集效價。為了保持抗原的紅細胞凝集活性，未稀釋的紅細胞凝集抗原應保存在零下60℃至零下70℃的環(huán)境中。

（1）材料的準備。（i）按表1配備磷酸緩沖鹽溶液（PBS）∶

表1 配備磷酸緩沖鹽溶液成分

若所有試劑都測量準確的話，磷酸鹽緩沖溶液的酸堿度（pH）將在7.1～7.2。

（ii）采集火雞或雞的紅細胞（RBC's）放置在肝素（1000單位/毫升）或阿氏液中保存， 阿氏液的配制方法如表2：

表2 阿氏液的配制成分

將檸檬酸鈉和氯化鈉溶于800毫升的蒸餾水中，并在15磅的壓力下滅菌15分鐘。

將葡萄糖溶于200毫升的蒸餾水中，用蔡氏過濾器或其他類型的過濾器對其進行滅菌，然后通過無菌操作將其加入無菌的檸檬酸鈉和氯化鈉溶液中。

（iii）從已知的不含所檢測支原體的火雞或雞身上，用含有肝素（每10毫升血液中大約含有0.2毫升肝素）或阿氏液的注射器，按照1∶5的比例（如：8毫升的血液配40毫升的阿氏液）抽取足量的血液。對血液離心10分鐘，轉速為1000rpm（轉/分鐘），然后用移液管去除上層清液。

（iv）用10倍量或更多份阿氏液或緩沖鹽水清洗紅細胞兩次，每一次清洗后都需以每分鐘1000rpm的轉速離心10分鐘。去除上清液后，用阿氏液或緩沖鹽水對紅細胞沉積物做懸浮處理，確保濃縮紅細胞在懸浮液中的濃度為25%（無論是檢測雞血清還是火雞血清，都必須使用同源的紅細胞，即檢測雞血清時要用雞的紅細胞，檢測火雞血清時，則需用到火雞的紅細胞）。若懸浮液需冷藏保存，則保存時間為采血后的7至8天。

（v）檢測時，將2毫升紅細胞濃度為25%的懸浮液加入到98毫升的緩沖鹽水中，制成終濃度為0.25%的紅細胞懸浮液。

（2）程序1。（i）所需材料：微量滴定儀（最?。?；即微孔板、微量稀釋器、微量移液器、極限稀釋轉移測量儀（0.05毫升）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）；從國家獸醫(yī)服務實驗室獲得的試劑，即紅細胞凝集抗原和待檢測支原體的滴定過的陰性和陽性血清；從未感染待檢測支原體的禽類體內獲得的終濃度為0.5%（2毫升紅細胞濃度為25%的懸浮液加入到98毫升的磷酸鹽緩沖溶液中配備而來）的同源紅細胞（RBCs）懸浮液。見本節(jié)段落（d）（1）（ii）至（v）有關紅細胞配制的介紹。

（ii）紅細胞凝集（HA）抗原滴定。標記出抗原滴定試驗的每一個孔，共兩排，每排10個孔（紅細胞凝集抗原滴定試驗需設置復孔檢測）；標記出每一排中最后一個孔，作為對照組；在小試管（12×75毫米）中，將0.1毫升的抗原與0.9毫升的磷酸緩沖鹽溶液混合，配制比例為1∶10的起始抗原稀釋液；向所有孔中加入0.05毫升的磷酸緩沖鹽溶液，包括對照組；將0.05毫升的抗原稀釋液（1∶10稀釋）加入到兩排的第1個孔中，充分混勻后，將稀釋液轉移到每排的第2個孔中進行混勻，以此類推一直到每排的第10個孔，用分裝檢測卡檢查從最后一個孔中取出稀釋液混合物，然后將稀釋液放入蒸餾水中，如果稀釋液檢查有效，抗原稀釋度將依次為1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560、1∶5120；用容量為0.05毫升的滴管向所有孔中加入0.05毫升濃度為0.5%的紅細胞懸浮液；若微孔板還需放置兩小時以上時，則將微孔板密封。搖動微孔板并于室溫下靜置，直到對照組中的細胞聚集成緊湊的紐扣狀。滴度是能產生完整凝集反應的最高稀釋度。0.05毫升稀釋液中包含1個紅細胞凝集單位；配制0.05毫升含8個紅細胞凝集單位的抗原稀釋液。例如：若抗原滴度為1∶640，則每0.05毫升的抗原稀釋液中含1個紅細胞凝集單位。用640除以8得80，那么1∶80稀釋的抗原稀釋液中含8個紅細胞凝集單位。用640除以4得160，那么1∶160稀釋后每0.05毫升的抗原稀釋中含有4個紅細胞凝集單位（見表3）。

表3 紅細胞凝集抑制試驗的樣本結果（試管和血清稀釋）

（iii）血凝抑制試驗。配制兩份抗原稀釋液，一份每0.05毫升包含8個紅細胞凝集單位，一份每0.05毫升包含4個紅細胞凝集單位。后者可通過往前者中混入等量的磷酸緩沖鹽溶液而獲得。每項檢測需標記出一排8個孔。

在小試管（12×75毫米）中配制每種待檢測血清1∶5的稀釋液：0.1毫升血清加0.4毫升磷酸鹽緩沖溶液或0.05毫升血清加0.20毫升磷酸鹽緩沖溶液。

用容量為0.05毫升的滴管將0.05毫升的磷酸鹽緩沖溶液加入到每排最后一個孔中。

將0.05毫升含8個紅細胞凝集單位的抗原加入到每排的第2個孔中。

將0.05毫升含4個紅細胞凝集單位的抗原加入到每排第3至8個孔中。

針對每份待檢測血清，在每排第1個孔，加入0.05毫升的稀釋液和上文第（iii）段配制的將1∶5稀釋的血清。

混合均勻后，從第1個孔中吸取血清稀釋液，轉移到第2個孔中，依次進行兩倍稀釋操作一直到第8個孔。

第1個孔（血清稀釋度為1∶10）為血清對照組。第2個孔＝1∶20稀釋度；第3個孔＝ 1∶40稀釋度；第4個孔＝1∶80稀釋度；第5個孔＝1∶160稀釋度；第6個孔＝1∶320稀釋度；第7個孔＝1∶640稀釋度；第8個孔＝1∶1280稀釋度。

抗原對照組。標記6個孔作為抗原對照組；將0.05毫升磷酸緩沖鹽溶液加入到第2、3、4、5和6個孔中；將0.05毫升含8個紅細胞凝集單位的抗原加入到第1和第2個孔中；用空的稀釋器，將第2個孔里的溶液混勻，并依次進行兩倍稀釋操作一直到第6個孔；第1個孔中包含8個紅細胞凝集單位，第2個孔中包含4個紅細胞凝集單位，第3個孔中包含2個紅細胞凝集單位，第4個孔中包含1個紅細胞凝集單位，第5個孔中包含1/2個紅細胞凝集單位，第6個孔中包含1/4個紅細胞凝集單位；標記兩個孔作為對照組，向每個孔中加入0.05毫升磷酸鹽緩沖溶液；在室溫下（20～23℃）孵育20至30分鐘，使抗體抗原充分發(fā)生反應，向所有孔中加入0.05毫升濃度為0.5%的紅細胞懸浮液；密封所有的孔（如果反應孔需放置2小時以上時）。充分搖勻微孔板；在室溫下孵育30至45分鐘。

解釋：血凝抑制效價是當反應板傾斜時通過紅細胞流下時，能夠呈現完整的紅細胞凝集抑制反應的最高血清稀釋度。效價為1∶80或更高的血清被視為陽性，效價為1∶40的被視為可疑。樣本檢測結果如本段表1所示。

（iv）如果不確定血凝試驗和血凝抑制試驗的檢測結果，則意味著至少間隔21天后，需對樣本進行病原培養(yǎng)。

（3）程序2。目的：通過紅細胞凝集抑制試驗（HI）檢測禽類支原體的抗體。本試驗運用抗原量不變、稀釋血清的方法來測量雞毒支原體、滑液囊支原體或火雞支原體的抗體。

（i）所需材料。雞毒支原體、滑液囊支原體，火雞支原體血凝抑制抗原；陽性和陰性對照血清；磷酸鹽緩沖溶液；96孔U型底微量滴定板；12道移液器（德國伯赫）；50微升移液器（皮佩曼，P200）；移液器吸頭；含0.5%同源紅細胞的磷酸鹽緩沖溶液（使用來自待檢測同一物種身上提取的紅細胞）；封板膜；鏡面讀數器。

（ii）紅細胞凝集（HA）抗原滴定。對支原體抗原進行標準紅細胞凝集（HA）檢測，以確定其抗原效價；將50微升磷酸鹽緩沖溶液加入到96孔微量滴定板的3排孔中；將50微升抗原原液加入到2排孔中；用12道移液器依次進行兩倍倍比稀釋（50微升）。稀釋比例為1∶2至1∶4096；向3排孔中加入50微升濃度為0.5%的同源紅細胞。未添加抗原的那一排作為紅細胞對照組。

在室溫下進行孵育（大約30分鐘）直到對照組紅細胞凝集成緊湊的紐扣狀。當最后一個孔中的紅細胞呈現出完整的彌散狀（紅細胞凝集）時，讀取紅細胞凝集效價。

為進行血凝抑制試驗，將抗原原液稀釋成含4個紅細胞凝集單位的抗原稀釋液。該含4個紅細胞凝集單位的抗原稀釋液是用抗原原液的紅細胞凝集效價除以8計算得出。（例如：1∶320紅細胞凝集單位除以8等于40，按1∶40的比例稀釋抗原原液）

（iii）紅細胞凝集抑制試驗。在96孔U底微孔板上標記出一列（A到H）為每個樣本、每個陽性和陰性對照組、抗原回滴孔和紅細胞對照的加樣孔。

將40微升的磷酸緩沖鹽溶液加入到微孔板的最上面一排（A排）的每個孔中。向該微孔板所有剩余的孔中加入25微升磷酸緩沖鹽溶液。

在A排每個孔中加入每份待測血清10微升（制成比例為1∶5的血清稀釋液）。

用12道移液器依次從A孔到H孔倍比稀釋25微升血清稀釋液。最后25微升溶液棄去，這樣各排的稀釋比例分別為：A排＝1∶5至H排1∶640。

用牛津劑量器，向B孔到H孔依次加入25微升含4個紅細胞凝集單位的抗原。A孔為血清對照組。

通過向其中一列的每個孔中加入25微升的磷酸鹽緩沖溶液來進行抗原回滴。向A孔中加入25微升的稀釋抗原，然后從A至D孔依次稀釋25微升，這樣抗原稀釋度依次為1∶2、1∶4、1∶8和1∶16。（建議在血凝抑制試驗中使用抗原稀釋液前，進行抗原會滴。這樣就可以在不合適的抗原稀釋液被用于血凝抑制試驗前及時發(fā)現不合適的抗原稀釋問題并進行糾正。）

其中一列孔中不添加抗原和血清，作紅細胞對照組用。輕輕攪拌并在室溫下孵育30分鐘。

向所有孔中加入50微升濃度為0.5%的紅細胞。注意：加入紅細胞后不要攪動（攪拌可能會導致紅細胞下沉，從而引起假陽性反應，形成“假”的紐扣狀凝塊）。

用封板膜蓋上反應板。在室溫下孵育30分鐘，或直至對照組中紅細胞形成一個緊湊的紐扣狀凝塊為止。

在鏡像平板讀數器上讀取反應結果。

（ⅳ）結果。效價指的是形成緊湊的紐扣狀紅細胞的最后一個稀釋度的倒數。最終稀釋方案包括稀釋計算中的抗原，具體如下，B＝1∶20、C＝1∶40、D＝1∶80、E＝1∶160、F＝1∶320、G＝1∶640、H＝1∶1280。

只有滿足以下條件，試驗才有效：陽性對照組血清效價應在此前已測定效價的一個滴度范圍內；陰性對照組血清必須呈陰性；抗原回滴結果必須為1∶4或1∶8；紅細胞對照組必須呈現緊湊且非溶血的紐扣狀凝塊；血清對照組（A排孔的每份待測血清）都不得出現非特異性凝集或溶血。如果為陰性，報告中應描述為“陰性，且無非特異性凝集或非特異性溶血”，或“由于非特異性凝集或溶血而無法評估”，或“處理血清，去除非特異性凝集，并重復試驗”。

去除非特異性凝集的處理。目的：處理血清，去除影響血凝抑制試驗的非特異性凝集。樣本：血清。

材料：同源紅細胞（雞或火雞），50%的磷酸鹽緩沖溶液、離心機、孵化器、冰箱（4℃）。

程序：將50微升的血清加入200微升的磷酸鹽緩沖溶液中，配制稀釋度為1∶5的試驗用血清；向磷酸鹽緩沖溶液中加入等量的濃縮紅細胞，配制濃度為50%的紅細胞溶液。均勻混合；將25微升濃度為50%的紅細胞溶液加入到血清稀釋液中；輕輕攪拌混勻；在4℃下孵育1小時；離心紅細胞形成小球狀；用上清液進行血凝抑制試驗。調整試驗中的稀釋方案時需考慮到處理過程中的初始1∶5血清稀釋液。在1∶5的血清稀釋方案中，不要在A排的孔中加入磷酸鹽緩沖溶液，而要在其中加入50微升1∶5稀釋的處理后的上清液。從A排到H排，依次倍比稀釋25微升，這樣從B排至H排血清稀釋度依次為1∶10到1∶640。

7 制備診斷試驗用蛋黃標本的程序

如下檢測條款適用于《聯邦法規(guī)匯編》中美國禽群雞毒支原體凈化相關內容、美國禽群滑液囊支原體凈化相關內容、美國禽群H5/H7禽流感受到監(jiān)控相關內容。

（a）在授權代理人或州檢察員的監(jiān)督下，用于蛋黃檢測的雞蛋必須是從種雞群所在的養(yǎng)殖場中挑選而來、必須包括從該雞群單日產出的雞蛋中所挑選出的30個雞蛋做代表性樣本、必須標記出來源雞群和雞舍且必須送往授權實驗室制備診斷試驗用檢測樣本。

（b）授權實驗室必須確認每個雞蛋來自哪個種雞群和雞舍，且在以下各個環(huán)節(jié)都需要保留該鑒定信息：

（1）用鈍器將雞蛋圓端敲開。

（2）將雞蛋的內容物倒入開放的容器中（使蛋黃裸露出來），并用針刺穿蛋黃。

（3）用1毫升不帶針頭的注射器，從蛋黃開口處抽吸0.5毫升蛋黃。

（4）將抽吸的蛋黃裝入一支試管中，然后在相同的試管中加入0.5毫升磷酸鹽緩沖溶液，將試管放在架子上。

（5）所有的雞蛋都取樣后，將試管架放置在旋轉振蕩器上30秒鐘。

（6）樣本以每分鐘2500 rpm的轉速（1000xg）離心30分鐘。

（7）對于用于保持美國禽群雞毒支原體和滑液囊支原體凈化分類的待檢測蛋黃樣本，檢測離心處理后的蛋黃上清液中是否含有雞毒支原體和滑液囊支原體應運用指定檢測血清和指定的檢測免疫球蛋白抗體的試驗程序（做這些實驗時，可用血清替代離心處理后的蛋黃上清液）。

對于用于美國禽群H5/H7禽流感監(jiān)測的待檢測蛋黃樣本，依據《聯邦法規(guī)匯編》中的要求檢測離心處理后的蛋黃上清液。

注意：評估任意蛋黃檢測試驗的結果時要記住，初始樣本配制時是用鹽水將蛋黃1∶2稀釋的。

8 禽流感標準試驗程序

（a）瓊脂凝膠免疫擴散（AGID）試驗。瓊脂凝膠免疫擴散（AGID）試驗被視為針對甲型流感病毒抗體的基本篩選試驗。瓊脂凝膠免疫擴散試驗被用來檢測針對甲型流感群特異性抗原的循環(huán)抗體，即核糖核蛋白（RNP）和基質蛋白（M）。因此，不論它們是哪種亞型毒株，本試驗針對甲型流感病毒的抗體均可檢測。瓊脂凝膠免疫擴散試驗也可以作為鑒定甲型禽流感病毒分離菌的群特異性試驗。使用的方法和比爾德（Beard）所描述的方法類似。瓊脂凝膠免疫擴散試驗的基礎是抗原和抗體通過瓊脂凝膠基質向彼此同時移動。當抗原和特異性抗體接觸時，它們會結合形成一種沉淀物，該沉淀物卡在凝膠基質中，形成一條肉眼可見的線條。沉淀物在抗原和抗體濃度最佳的地方形成線條。抗原和抗體相對濃度的變化會使該線條的位置移向孔中濃度最低的地方，或不會形成一條沉淀物線條。電解質濃度、酸堿度、溫度和其他變量也會影響沉淀物的形成。

（1）所需材料：冰箱（4℃）；冷凍箱（零下20℃）；用于室溫（約25℃）孵育的孵化器或密閉容器；高壓滅菌器；加熱板/攪拌器和磁力攪拌棒（可選）；真空泵；顯微鏡照明器或其他合適的光源，用于讀取結果；免疫擴散模板切割器、七孔模型（中心孔周圍由六個間隔均勻的孔組成）?？椎闹睆綖?.3毫米，間隔2.4毫米；上皿天平（能夠測量0.1克的差異）；可吸取50微升溶液的吸移器；常見實驗室物品和玻璃器皿—錐形瓶、刻度量筒、移液管、100×15毫米或60×15毫米培養(yǎng)皿、真空軟管、支管燒瓶（500毫升或更大）以及一根12或14號平頭端插管。

（2）所需試劑：磷酸鹽緩沖液（PBS），0.01M，pH7.2（國家獸醫(yī)服務實驗室的培養(yǎng)基#30054或等同物）；瓊脂糖（培養(yǎng)基II型中等，西格瑪化工有限公司#A-6877或等同物）；美國農業(yè)部和官方國家機構批準的禽流感瓊脂凝膠免疫擴散抗原和陽性對照血清；美國農業(yè)部和官方國家機構批準的強陽性、弱陽性和陰性對照血清。（陰性對照血清可選可不選）。

（3）配制禽流感瓊脂凝膠免疫擴散瓊脂：向裝有1升磷酸鹽緩沖溶液（0.01M，pH為7.2）的2升錐形瓶中加入9克瓊脂糖和80克氯化鈉。

可通過如下方式混合瓊脂：將混合物高壓滅菌10分鐘，從高壓滅菌器中取出后，通過旋轉的方式進行混合，確保成分均勻混合；在電熱板上通過煮沸來溶解混合物，在加熱的過程中，用磁力攪拌棒使錐形瓶中的內容物混合。沸騰后，讓瓊脂在室溫（約25℃）下冷卻10～15分鐘，然后將其轉移到培養(yǎng)皿中。

可將瓊脂分裝成小份（日常工作容積），并在4℃下儲存在密閉容器中幾周，需要時再將其融化放入培養(yǎng)皿中。注意：當觀察到瓊脂被雜菌感染或有沉淀物時，請勿使用。

（4）進行瓊脂凝膠免疫擴散。（i）檢測血清抗體。用容量為25毫升的移液管，將15至17毫升融化的瓊脂加入到100×15毫升的培養(yǎng)皿中，或將5至6毫升的瓊脂加入到60×15毫升的培養(yǎng)皿中。瓊脂的厚度約為2.8毫米。

讓平皿在相對無塵的環(huán)境中冷卻，揭開蓋子蒸發(fā)出水蒸氣。蓋子應揭開至少15分鐘，但不得超過30分鐘，因為水分蒸發(fā)可能會改變瓊脂電解液的濃度，從而對沉淀物線條有不利影響。注意：倒入瓊脂后，應在24小時內使用平皿。

記錄樣本編號、試劑批號、檢測日期和檢測及讀取檢測結果人員。

瓊脂硬化后，用模板將瓊脂切開。100×15毫米的平板上最多可切出7個模板模式、60×15毫米的平板上最多可切出2個模板模式。

用一根12或14號插管將瓊脂膠塞吸開，該插管通過一塊硅膠或一根橡膠管連接在支管燒瓶上，燒瓶通過管狀物連接在一個真空泵上。調整真空度，以便在取下瓊脂塞時，孔周圍的瓊脂不會受到干擾。

在準備反應孔時，用帶有吸頭的微量移液管，將50微升禽流感瓊脂凝膠免疫擴散抗原加入到位于中心的孔中。將50微升的禽流感瓊脂凝膠免疫擴散陽性血清，分別加入到周圍三個孔中，且每兩個孔之間間隔一個孔，然后在剩余的三個孔中各加入50微升待檢血清。這種安排能保證每一份待檢血清的旁邊都有一個陽性對照組線條，從而為每一份待檢血清兩側沉淀物線條的形成做準備（見圖1）。注意：一種圖案的測試血清孔中可包含陽性、弱陽性和陰性參照血清，以幫助闡釋結果（見圖2）。

填充完所有的孔后，將所有微孔板都蓋起來，讓微孔板放入封閉的反應室中防止蒸發(fā)，并在室溫（大約25℃）下孵育24小時。應在培養(yǎng)室中放一張濕紙巾以保證濕度。注意：移位過程中溫度的變化可能會導致不準確的結果。

（ii）解釋檢測結果。將平皿放在黑色的背景上，取下蓋子并檢查反應結果，并從下方成一定角度地用光源照亮平皿。顯微鏡發(fā)光器很有幫助，能夠調整照明位置和光照強度。

反應的類型將隨待檢測樣本中抗體的濃度而變化。陽性對照血清的沉淀線是讀取測試結果的依據。如果該線條不清晰，則試驗無效，必須重做。會觀察到如下幾種類型的反應（見圖3）：

陰性反應。在試驗樣品孔中，對照組線條繼續(xù)保持原樣，而不會彎曲或稍微發(fā)生彎曲，遠離抗原孔，靠近陽性對照組血清孔。

陽性反應。陽性對照組線條與待檢血清和抗原之間的線相結合，或與之形成一條連續(xù)的線（同一線）。該線條的位置將取決于待檢血清中抗體的濃度。弱陽性樣本可能不會在抗原和待檢血清之間產生一條完整的沉淀線，但可能只是引起對照組線條末端向內彎曲，靠近待檢血清孔。

非特異性線條。偶爾在抗原和待檢血清孔之間會觀察到這些線。陽性對照組線條會穿過非特異性線條，繼續(xù)進入待檢血清孔。非特異性線條不會與陽性對照組線條形成連續(xù)線。

免疫擴散試驗（圖1），中間孔中加入的是禽流感瓊脂凝膠免疫擴散抗原；A和D孔中加入的是禽流感陽性對照血清；B，C，E和F孔中加入的是禽流感陰性測試血清。

◎圖1

免疫擴散試驗（圖2），中間孔中加入的是禽流感瓊脂凝膠免疫擴散抗原；A、C和E孔中加入的是禽流感陽性對照血清；B，D和F孔中加入的是禽流感陰性測試血清。

◎圖2

免疫擴散試驗（圖3），中間孔中加入的是禽流感瓊脂凝膠免疫擴散抗原；A、C和E孔中加入的是禽流感陽性對照血清；B孔中加入的是禽流感陰性測試血清；D孔中加入的是禽流感陽性測試血清；F孔中加入的是弱陽性測試血清。

◎圖3

（b）酶聯免疫吸附測定（ELISA）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）可用作禽流感篩查試驗。只能使用聯邦許可的酶聯免疫吸附試驗試劑盒，并按照制造商說明書進行操作。所有酶聯免疫吸附試驗陽性血清樣本必須經過瓊脂凝膠免疫擴散試驗的確認，確認試驗需按照本節(jié)（a）段中的方法執(zhí)行。