草魚(yú)干擾素3蛋白多克隆抗體制備及其應(yīng)用

范成堅(jiān)，蘇博洋，蘇建國(guó)

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070；2.武漢市洪山高級(jí)中學(xué)，武漢 430070)

草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)是我國(guó)產(chǎn)量最高的大宗淡水魚(yú)，2016年草魚(yú)產(chǎn)量達(dá)589.88萬(wàn)噸，占我國(guó)淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量的18.55%[1]，對(duì)穩(wěn)定我國(guó)水產(chǎn)品市場(chǎng)具有舉足輕重的作用。草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)長(zhǎng)期受到病害問(wèn)題的困擾。每年因草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)引起的草魚(yú)出血病造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)十多億元[2-3]。闡明草魚(yú)抗病毒免疫機(jī)制，為新型疫苗研究提供支撐。

2015年草魚(yú)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)在Nature genetics上發(fā)表并公布，為深入系統(tǒng)研究草魚(yú)基因功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[4]。I型干擾素在抗病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[5]。系統(tǒng)篩查草魚(yú)基因組發(fā)現(xiàn)草魚(yú)Ⅰ型干擾素有4個(gè)成員組成(IFN1-4)，II型干擾素有2個(gè)成員組成(IFNγ1-2)[6]。草魚(yú)IFN3位于草魚(yú)2號(hào)染色體上，基因體1 770 bp，包含4個(gè)內(nèi)含子，編碼序列564 bp，編碼的前體蛋白由187個(gè)氨基酸組成。成熟肽由167個(gè)氨基酸組成，分子量19.23 kD，等電點(diǎn)4.77。草魚(yú)IFN3含有4個(gè)半胱氨酸，屬于I型II群IFNc亞群[4]。草魚(yú)腎細(xì)胞系(C.idellakidney，CIK)在草魚(yú)抗病毒免疫研究中廣泛使用。在CIK細(xì)胞系中，IFN1和IFN3的表達(dá)量比IFN2和IFN4高出3個(gè)數(shù)量級(jí)[7]。在RIG-I(Retinoic acid-inducible gene I)和MDA5(Melanoma differentiation-associated gene 5)過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系中，GCRV感染或poly(I∶C)(Polyinosinic∶polycytidylic acid)刺激早期，IFN3的表達(dá)量極顯著上調(diào)[7]。這些現(xiàn)象表明草魚(yú)IFN3在抗病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。

本研究構(gòu)建草魚(yú)IFN3成熟肽原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，將純化后的蛋白免疫BALB/c小鼠，制備多克隆抗體。間接ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)，western blot鑒定多克隆抗體特異性。在草魚(yú)個(gè)體水平和CIK細(xì)胞水平上檢測(cè)草魚(yú)IFN3的蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步深入解析草魚(yú)抗病毒免疫機(jī)制奠定蛋白水平上檢測(cè)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

草魚(yú)呼腸孤病毒(GCRV)097株由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所汪亞平研究員惠贈(zèng)，屬于GCRV-II型；草魚(yú)腎細(xì)胞系(CIK)購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PCR Mix、BamH I酶、XhoI酶、T4連接酶和質(zhì)粒提取試劑盒等購(gòu)自武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司；大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌株、pGEX-4T-1質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡體重16～18克的BALB/c小鼠5只，在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)并制備抗體用；500 g左右草魚(yú)購(gòu)于湖北省武漢市團(tuán)風(fēng)百榮漁場(chǎng)，在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)3周以上。

1.3 草魚(yú)IFN3基因擴(kuò)增

根據(jù)GenBank(KU182642)中草魚(yú)IFN3的mRNA序列，分析得到編碼成熟肽的序列，設(shè)計(jì)引物，上游引物：5′-GATGGATCCTTGCCAACAAACTGCATCCT-3′；下游引物：5′-ATACTCGAGCTAGGGTTGTGGAGATTCATACAT-3′(下劃線序列分別為BamH I和XhoI酶切位點(diǎn))。20 μL PCR反應(yīng)體系：10 μL Primerstar，上、下游引物分別為0.5 μL，1 μL草魚(yú)頭腎巨噬細(xì)胞cDNA作為模版，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.4 pGEX-4T-1原核表達(dá)載體構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI對(duì)PCR擴(kuò)增、純化的草魚(yú)IFN3片段和表達(dá)載體pGEX-4T-1進(jìn)行雙酶切，37 ℃水浴酶切3.5 h，純化后連接。反應(yīng)體系：T4連接酶1 μL，Buffer 1 μL，pGEX-4T-1載體2 μL，IFN3片段6 μL。16 ℃水浴連接過(guò)夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌株，提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI雙酶切鑒定正確后，送樣至武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序，經(jīng)確認(rèn)的重組載體命名為pGEX-4T-1-IFN3。

1.5 誘導(dǎo)表達(dá)IFN3蛋白及純化

將上述陽(yáng)性菌在LB/Amp液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)(分5管)，測(cè)定光密度為(A600=1)時(shí)，加入IPTG(終濃度分別為：0、0.5、1、2、3 mmol/L)誘導(dǎo)10 h，收集菌體，超聲波(工作5 s，間歇10 s，功率250 W)裂解菌體(注意保持低溫環(huán)境)，收集破碎后的上清和沉淀。SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)情況及表達(dá)形式。按Novagen GST 試劑盒中的操作手冊(cè)進(jìn)行純化。

1.6 IFN3多克隆抗體的制備

用5只6周齡、體重16～18 g BALB/c小鼠制備多克隆抗體，其中1只每次注射等量生理鹽水為陰性對(duì)照。抗原乳化，對(duì)小鼠進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量50、100、150和200 μg。初次免疫使用弗氏完全佐劑，之后均使用弗氏不完全佐劑。第0周、第2周和第4周各免疫一次，第5周進(jìn)行斷尾取血，測(cè)定抗體效價(jià)。效價(jià)達(dá)到要求，可再加強(qiáng)一次免疫，一周后摘眼球取血，收集血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 間接ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)

用pH9.6濃度為0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液將純化的重組蛋白稀釋為50 ng/mL，包被96孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃冰箱包被過(guò)夜。次日每孔加1% BSA 200 μL在37 ℃封閉2 h后，用pH 7.4的PBST洗滌3次。加入等梯度稀釋(1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200)的血清各100 μL，陰性對(duì)照為1∶50稀釋的免疫前血清，空白對(duì)照為鼠血清稀釋液(PBS)，每份3個(gè)平行，37 ℃孵育1 h后，同上洗滌3次。每孔加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)100 μL，37 ℃孵育1 h后，同上洗滌3次。每孔加入100 μL的TMB顯色液，37 ℃避光反應(yīng)20 min后，每孔加入50 μL 2 mol/L的H2SO4終止液。酶標(biāo)儀上讀取A450值，(樣品吸光值-空白吸光值)/(陰性吸光值-空白吸光值)>2.1為陽(yáng)性。

1.8 Western blot分析IFN3抗體特異性

將純化的IFN3重組蛋白、CIK細(xì)胞提取蛋白分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至NC膜上，于2%的BSA封閉液中室溫封閉2 h；一抗為1∶1 000稀釋的上述血清，4 ℃孵育過(guò)夜；二抗為1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃作用1 h；每次反應(yīng)后均用TBST洗3～5次，每次5 min。用TMB顯色劑顯色并觀察結(jié)果。

1.9 細(xì)胞水平病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)IFN3蛋白表達(dá)

CIK細(xì)胞傳代至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層鋪滿80 %左右后，感染GCRV-097病毒，未感染病毒的正常細(xì)胞作為陰性對(duì)照。感染后6、12、24、48和72 h收集細(xì)胞，提取蛋白。Western blot檢測(cè)IFN3在CIK細(xì)胞感染GCRV后不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)。

1.10 個(gè)體水平不同組織IFN3蛋白表達(dá)

對(duì)暫養(yǎng)3周以上500 g左右的3尾草魚(yú)解剖，取免疫相關(guān)組織(頭腎、中腎、脾臟、肝胰腺、鰓、皮膚和腸)，3尾魚(yú)相應(yīng)組織樣品混合提取蛋白。

Western blot檢測(cè)IFN3在草魚(yú)不同組織中的蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增IFN3及鑒定

PCR擴(kuò)增IFN3，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示：在500 bp上方有一條特異性條帶，與理論大小一致。限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI對(duì)擴(kuò)增片段及質(zhì)粒pGEX-4T-1進(jìn)行雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌株、雙酶切鑒定、測(cè)序確認(rèn)。

圖1 草魚(yú)IFN3基因擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Amplification result of grass carp IFN3 PCR product 1.IFN3基因PCR產(chǎn)物；M.DNA Marker 2000

2.2 IFN3蛋白原核表達(dá)和表達(dá)形式分析

陽(yáng)性菌株用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖2)顯示：泳道1未出現(xiàn)明顯目標(biāo)蛋白條帶，泳道2-5出現(xiàn)一條明顯的重組蛋白條帶(約45kD)，與理論大小相符。泳道6、7未見(jiàn)明顯的重組蛋白條帶(上清)，泳道8、9重組蛋白含量較多(沉淀)。表明目標(biāo)蛋白主要以包涵體形式存在。

圖2 SDS-PAGE分析重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-IFN3表達(dá)產(chǎn)物及其可溶性Fig.2 The expression protein of pGEX-4T-1-IFN3 and the dissolubility of the recombinant protein by SDS-PAGE analysisA：誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；B：可溶性結(jié)果。M.蛋白質(zhì)marker；1.未誘導(dǎo)；2.0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；3.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；4.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；5.3 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；6～7.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物上清；8～9.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物沉淀

2.3 IFN3蛋白純化

純化后蛋白如圖3所示，條帶單一，無(wú)明顯雜帶，且大小與理論值(帶GST標(biāo)簽后約45kD)一致，表明蛋白純化效果好。

圖3 IFN3重組蛋白純化后SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE of the purified protein productsM.蛋白質(zhì)marker 1；1.純化的IFN3重組蛋白

2.4 血清抗體效價(jià)

使用間接ELISA法測(cè)定血清多克隆抗體效價(jià)，結(jié)果表明草魚(yú)IFN3重組蛋白制備的多克隆抗體效價(jià)約為1∶3 200。

2.5 Western blot檢測(cè)抗體特異性

為了檢測(cè)抗體的特異性，對(duì)IFN3重組蛋白及CIK細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4所示。重組蛋白有一條約45kD的條帶(帶GST標(biāo)簽)，GCRV刺激CIK細(xì)胞24 h后的細(xì)胞蛋白有一條約19 kD的條帶(內(nèi)源蛋白)。結(jié)果與理論一致且無(wú)明顯雜帶，表明所制備抗體的特異性強(qiáng)。

2.6 CIK細(xì)胞水平上的時(shí)間依賴性表達(dá)

GCRV感染CIK細(xì)胞后，IFN3在感染后6、12、24、48和72 h的蛋白表達(dá)如圖5所示。在感染早期，IFN3蛋白的表達(dá)檢測(cè)不到，在感染12 h后開(kāi)始出現(xiàn)條帶，且隨著時(shí)間推移，目標(biāo)條帶逐漸加深變寬，表明其表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。

圖5 GCRV感染CIK細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)IFN3的表達(dá)Fig.5 IFN3 protein expressions in CIK cells post GCRV infection1.未感染；2.GCRV感染6 h；3.GCRV感染12 h；4.GCRV感染24 h；5.GCRV感染48 h；6.GCRV感染72 h

2.7 草魚(yú)個(gè)體水平上不同組織表達(dá)

IFN3蛋白在草魚(yú)免疫相關(guān)組織(頭腎、中腎、脾臟、肝胰腺、鰓、皮膚和腸)中的蛋白表達(dá)如圖6所示，僅在皮膚和肝胰腺中檢測(cè)到表達(dá)，其他組織表達(dá)量很低或不表達(dá)。

圖6 草魚(yú)主要免疫相關(guān)組織IFN3的表達(dá)Fig.6 IFN3 protein expressions in major immune-related tissues in grass carp1.腸；2.皮膚；3.鰓；4.肝胰臟；5.脾臟；6.中腎；7.頭腎

3 討論

干擾素屬于II型細(xì)胞因子，最初是因其具有干擾病毒復(fù)制的能力而命名為干擾素。1957年，在研究流感病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)在雞胚中注射滅活病毒后，雞胚膜中產(chǎn)生一種抗病毒蛋白，即為“干擾素”(Interferon，IFN)[8]。現(xiàn)已證明干擾素作為多效性的細(xì)胞因子在生物體中普遍存在[9]，除了抗病毒作用外，它還參與其他重要的生理過(guò)程，如調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡以及機(jī)體免疫反應(yīng)等。所以，深入研究干擾素及其作用機(jī)制，對(duì)于魚(yú)類(lèi)病毒性疾病的防治具有重要的理論和實(shí)際意義[10]。

IFN3屬于I型干擾素。目前I型干擾素是研究最多、最深入的干擾素[6]。魚(yú)類(lèi)I型干擾素具有廣譜抗病毒活性。Altmann等[11]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了斑馬魚(yú)IFN基因的細(xì)胞對(duì)桿狀病毒的抵抗力顯著提高。不僅內(nèi)源性IFN具有抗病毒活性，體外重組表達(dá)的I型IFN對(duì)于機(jī)體或細(xì)胞也具有較好的保護(hù)作用[12]。Li等[13]研究斑馬魚(yú)重組IFN1(zfrIFN1)對(duì)傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)感染斑馬魚(yú)引起急性病毒感染的抑制作用，發(fā)現(xiàn)zfrIFN1能夠強(qiáng)烈抑制ISKNV對(duì)斑馬魚(yú)的急性感染并且啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng)。在哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)中，干擾素和重組干擾素已應(yīng)用于臨床實(shí)踐，例如重組IFNα/β已被廣泛用于抑制腫瘤和治療病毒性疾病[14-15]，然而在魚(yú)類(lèi)生產(chǎn)實(shí)踐中，應(yīng)用干擾素提高魚(yú)類(lèi)自身免疫力，增強(qiáng)其抗病力的工作尚在初級(jí)階段[16]。

盡管人們對(duì)草魚(yú)病毒病的防治進(jìn)行了一些卓有成效的探索，但這些方法或多或少存在一些不足之處。具有廣譜抗病毒作用的干擾素可能是防治草魚(yú)病毒性疾病的一種新途徑[17]。邵健忠等[16]研究草魚(yú)干擾素對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能，結(jié)果表明：草魚(yú)干擾素對(duì)草魚(yú)巨噬細(xì)胞(Mφ)具有顯著的激活作用，它能提高M(jìn)φ內(nèi)O2-、H2O2和ACP的活性與含量，促進(jìn)Mφ的吞噬和殺菌作用。將人IFNα基因序列轉(zhuǎn)入到草魚(yú)基因組內(nèi)，成功獲得表達(dá)人IFNα蛋白的轉(zhuǎn)基因草魚(yú)，通過(guò)一段時(shí)間的養(yǎng)殖發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因草魚(yú)的抗病能力較普通草魚(yú)的抗病能力高[18-19]。吳初新等[20]純化草魚(yú)Ⅰ型干擾素重組蛋白，將重組蛋白添加到飼料中，投喂草魚(yú)2 d后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果顯示攻毒21 d后，投喂重組蛋白組的成活率達(dá)63.33%，表明重組IFN蛋白可以作為一種新型魚(yú)類(lèi)免疫制劑。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們獲得了草魚(yú)IFN3多克隆抗體，并檢測(cè)了其在草魚(yú)不同免疫組織中的表達(dá)差異，以及其在CIK細(xì)胞中應(yīng)對(duì)GCRV感染的時(shí)間依賴性表達(dá)。結(jié)果顯示在肝胰臟和皮膚中檢測(cè)到特異性條帶，在CIK感染GCRV 12 h后出現(xiàn)特異性條帶，這與邵健忠等[21]研究的草魚(yú)干擾素誘生結(jié)果一致。本研究為進(jìn)一步深入解析草魚(yú)抗病毒免疫機(jī)制奠定蛋白水平上檢測(cè)的基礎(chǔ)，同時(shí)為干擾素在草魚(yú)病害防治上的開(kāi)發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。