術(shù)前新輔助化療對宮頸癌患者手術(shù)切除病灶內(nèi)惡性分子表達(dá)的影響

劉志文，馮慧芳，夏麗偉，吳又明，林曉嵐

隨著近年來健康體檢的推廣及普及、宮頸癌的早期診斷率得到了較大提高，臨床分期≤Ⅱa期的宮頸癌預(yù)后較好。在臨床分期≤Ⅱa期的宮頸癌中，Ⅰb2和Ⅱa2屬于局部晚期腫瘤，相比Ⅰb1期和Ⅱa1期80%以上的5年生存率，局部晚期宮頸癌手術(shù)切除后的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高[1]。宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲所造成的癌細(xì)胞局部浸潤是導(dǎo)致手術(shù)切除后微病灶殘留的重要因素，也直接增加了術(shù)后轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的風(fēng)險。新輔助化療是針對中晚期惡性腫瘤提出的治療策略，通過術(shù)前全身或局部應(yīng)用化療藥物來殺傷腫瘤細(xì)胞、降低腫瘤分期，進(jìn)而為手術(shù)切除病灶創(chuàng)造有利條件。近年來，也有研究報道了新輔助化療用于局部晚期宮頸癌的價值，在手術(shù)切除的基礎(chǔ)上使用新輔助化療能夠有效延長患者的無瘤生存時間[2]，但關(guān)于新輔助化療對局部晚期宮頸癌病灶內(nèi)癌細(xì)胞惡性生物學(xué)特征的影響尚未明確。在本研究中，筆者具體分析了術(shù)前新輔助化療對局部晚期宮頸癌患者手術(shù)切除病灶內(nèi)惡性分子表達(dá)的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年3月—2017年6月期間在南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院婦產(chǎn)科診斷為Ⅰb2和Ⅱa2期宮頸癌的患者作為研究對象，所有患者均經(jīng)病理學(xué)活檢診斷為宮頸鱗癌，結(jié)合影像學(xué)檢查判斷FIGO分期為Ⅰb2和Ⅱa2期；排除既往有其他惡性腫瘤病史、入組前接受過放化療的患者。共納入118例患者，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為試驗(yàn)組和對照組，每組各59例。試驗(yàn)組在接受新輔助化療后進(jìn)行手術(shù)切除，年齡39～49(42.8±5.2)歲；Ⅰb2期32例，Ⅱa2期27例；病灶直徑2.7～5.5( 4.2±0.6)cm。對照組患者直接進(jìn)行手術(shù)切除，年齡37～47(43.2±5.5)歲；Ⅰb2期34例，Ⅱa2期25例；病灶直徑2.5～5.3(4.5±0.7)cm。2組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 治療方法 試驗(yàn)組患者按照紫杉醇+順鉑的方案進(jìn)行新輔助化療，化療前6 h和12 h均給予地塞米松10 mg肌肉注射，而后給予紫杉醇175 mg/m2，d 1，靜脈滴注，順鉑100 mg/m2，d 1～3，靜脈滴注，21 d為1個周期，共進(jìn)行2個周期?；熃Y(jié)束后2～3周，復(fù)查肝腎功能排除手術(shù)禁忌證后進(jìn)行手術(shù)切除治療。對照組患者不行新輔助化療，直接進(jìn)行手術(shù)切除治療。

1.3 病灶惡性分子表達(dá)量的測定 取2組患者手術(shù)切除的腫瘤病灶適量送深圳華大基因科技有限公司，采用RNA提取試劑盒分離病灶內(nèi)RNA，采用cDNA合成試劑盒將RNA樣本反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后用PCR試劑盒配置反應(yīng)體系：cDNA 2 μl、反應(yīng)混合液10 μl、引物混合液0.8 μl、去離子水7.2 μl。將配置好的反應(yīng)體系放置在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，得到反應(yīng)曲線后自動生成循環(huán)閾值(Ct)，根據(jù)公式2-ΔΔCt計算促增殖分子[Ki-67、人細(xì)胞周期相關(guān)激酶(CCRK)、細(xì)胞周期蛋白B1(CyclinD1)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)、Polo樣激酶1(Plk1)、生成素(Survivin)]、抑癌基因[多亮氨酸重復(fù)區(qū)免疫球蛋白樣蛋白1(LRIG1)、p16基因、真核起始因子4E3(eIF4E3)、N-myc下游調(diào)節(jié)基因4(NDRG4)、Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域因子2A(RASSF2A)、增強(qiáng)子結(jié)合蛋白1(Ebp1)]及侵襲基因[β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-8(MMP-8)、解聚素—金屬蛋白酶19(ADAM19)、金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP1)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)]的表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 促增殖分子表達(dá)量的比較 結(jié)果顯示，試驗(yàn)組患者的宮頸癌病灶內(nèi)Ki-67、CCRK、CyclinB1、CDK1、Plk1、Survivin的mRNA表達(dá)量顯著低于對照組，2組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.2 抑癌基因表達(dá)量的比較 結(jié)果顯示，試驗(yàn)組患者的宮頸癌病灶內(nèi)LRIG1、p16、eIF4E3、NDRG4、RASSF2A、Ebp1的mRNA表達(dá)量顯著高于對照組，2組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

2.3 侵襲基因表達(dá)量的比較 結(jié)果顯示，試驗(yàn)組患者的宮頸癌病灶內(nèi)β-catenin、MMP-8、ADAM19的mRNA表達(dá)量顯著低于對照組，TIMP1、E-cadherin的mRNA表達(dá)量顯著高于對照組，2組間比較差有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表1 2組宮頸癌病灶內(nèi)Ki-67、CCRK、CyclinB1、CDK1、Plk1、Survivin表達(dá)量的比較

表2 2組宮頸癌病灶內(nèi)LRIG1、p16、eIF4E3、NDRG4、RASSF2A、Ebp1表達(dá)量的比較

表3 2組宮頸癌病灶內(nèi)β-catenin、MMP-8、ADAM19、TIMP1、E-cadherin表達(dá)量的比較

3 討 論

Ⅰb2和Ⅱa2期宮頸癌被定義為局部晚期宮頸癌，Ⅰb2期是指腫瘤病灶局限于宮頸且病灶最大直徑超過4 cm，Ⅱa2期是指腫瘤病灶超出子宮頸并累及陰道、但未達(dá)到陰道下1/3且無宮旁浸潤。相比Ⅰb1及Ⅱa1宮頸癌，Ⅰb2和Ⅱa2期宮頸癌病灶內(nèi)癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力較強(qiáng)，存在較為顯著的局部微浸潤，手術(shù)切除后容易殘留微病灶并增加局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，Ⅰb2和Ⅱa2期宮頸癌的預(yù)后也相對較差。近年來，新輔助化療被越來越多地用于惡性腫瘤的輔助治療，術(shù)前通過全身或局部使用化療藥物來殺傷癌細(xì)胞，進(jìn)而能夠縮小腫瘤體積及微浸潤范圍，同時也能在一定程度上減輕盆腔充血程度、松動腫瘤鄰近的宮旁組織，有利于手術(shù)對病灶的徹底切除[3-4]。已有研究報道，新輔助化療用于局部晚期宮頸癌能夠提高總生存率、延長無瘤生存時間[5]，但關(guān)于新輔助化療對局部晚期宮頸癌病灶內(nèi)增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為的影響尚未明確。

宮頸癌病灶的生長與病灶內(nèi)癌細(xì)胞活躍的增殖密切相關(guān)，而癌細(xì)胞的增殖又受到了多種促增殖分子的調(diào)控。Ki-67是細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞增殖活力直接相關(guān)的抗原，參與了細(xì)胞增殖過程中DNA復(fù)制的調(diào)控[6]。CCRK是參與細(xì)胞周期正性調(diào)控的上游分子，能夠催化下游信號分子的磷酸化并增加多種細(xì)胞周期蛋白的活化。CyclinB1及其激酶CDK1受到細(xì)胞周期相關(guān)激酶(CCRK)的調(diào)控，在CCRK作用下發(fā)生活化的CyclinB1及CDK1能夠形成復(fù)合體，進(jìn)而加速細(xì)胞周期通過G2/M檢查點(diǎn)并進(jìn)入有絲分裂階段，有助于促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]。Plk1是新發(fā)現(xiàn)的一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，同樣能夠促進(jìn)CyclinB1/CDK1復(fù)合體的形成，進(jìn)而加速細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞增殖。Survivin是抗凋亡蛋白家族中活性最強(qiáng)的成員，能夠與凋亡級聯(lián)激活通路中的多種Caspase分子結(jié)合并拮抗其活性，進(jìn)而阻礙細(xì)胞凋亡過程的進(jìn)展并為細(xì)胞增殖創(chuàng)造有利條件[8]。筆者通過分析宮頸癌病灶內(nèi)以上促增殖分子表達(dá)量的改變發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，試驗(yàn)組患者的宮頸癌病灶內(nèi)Ki-67、CCRK、CyclinB1、CDK1、Plk1、Survivin的mRNA表達(dá)量顯著降低。這就說明新輔助化療能夠減少局部晚期宮頸癌病灶內(nèi)多種促增殖分子的表達(dá)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖。

宮頸癌病灶內(nèi)癌細(xì)胞的增殖不僅與促增殖分子表達(dá)的上調(diào)有關(guān)，同時還與多種具有促凋亡及增殖抑制效應(yīng)的抑癌基因的低表達(dá)或表達(dá)缺失有關(guān)。LRIG1是新發(fā)現(xiàn)的宮頸癌相關(guān)抑癌基因，其編碼產(chǎn)物是一類跨膜蛋白，能夠?qū)Χ喾N生長因子所介導(dǎo)的細(xì)胞生長效應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。p16又稱為MTS1，在細(xì)胞周期中能夠使多種細(xì)胞周期蛋白相關(guān)激酶的活性發(fā)生抑制，進(jìn)而限制細(xì)胞周期的發(fā)展并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[10-11]。eIF4E3是一類真核細(xì)胞內(nèi)的翻譯起始因子，具有潛在的抑癌活性，主要通過阻礙細(xì)胞周期來產(chǎn)生抑癌作用[12-13]。NDRG4是N-myc調(diào)控通路的下游分子，能夠?qū)I3K/AKT通路的激活產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而減弱由該通路所介導(dǎo)的細(xì)胞增殖。RASSF2A是RAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的負(fù)性調(diào)控分子，具有RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域，能夠阻礙RAS所介導(dǎo)的增殖效應(yīng)并促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。Ebp1是一類ErbB-3胞內(nèi)結(jié)合蛋白，在外界理化因素的刺激下會與ErbB-3分離并向細(xì)胞核內(nèi)移位，進(jìn)而對細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用[15-16]。筆者通過分析宮頸癌病灶內(nèi)以上抑癌基因表達(dá)量的改變發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，試驗(yàn)組患者的宮頸癌病灶內(nèi)LRIG1、p16、eIF4E3、NDRG4、RASSF2A、Ebp1的mRNA表達(dá)量顯著降低。這就說明新輔助化療能夠增加局部晚期宮頸癌病灶內(nèi)多種抑癌基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。

宮頸癌細(xì)胞在增殖的基礎(chǔ)上向鄰近組織及脈管系統(tǒng)的侵襲是造成腫瘤局部浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)行為，多種侵襲調(diào)控分子與之密切相關(guān)。Wnt通路是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控蛋白酶表達(dá)、影響細(xì)胞侵襲活力的重要信號通路，在Wnt通路處于靜息狀態(tài)時，下游分子Frizzled蛋白、GSK-3β以及β-catenin形成復(fù)合體并對β-catenin產(chǎn)生水解作用；當(dāng)Wnt通路發(fā)生激活時，β-catenin復(fù)合體解離、其受到的水解作用也相應(yīng)減弱，進(jìn)而造成β-catenin在細(xì)胞內(nèi)聚集并不斷向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位[17-18]。在β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后，能夠啟動MMP-8、ADAM19等多種蛋白酶的表達(dá)。MMP-8是重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，而ADAM19則兼具解聚素及金屬蛋白酶活性，兩者對細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的多種成分具有水解作用，進(jìn)而能夠促進(jìn)細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)的限制并呈浸潤性生成的態(tài)勢。TIMP1是蛋白酶活性的直接抑制分子，能夠使蛋白酶的水解活性減弱并抑制細(xì)胞的侵襲；E-cadherin則是上皮細(xì)胞的標(biāo)志分子，有助于細(xì)胞間形成緊密連接并阻礙細(xì)胞的運(yùn)動及侵襲[19-20]。筆者通過分析宮頸癌病灶內(nèi)以上侵襲基因表達(dá)量的改變發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，試驗(yàn)組宮頸癌病灶內(nèi)β-catenin、MMP-8、ADAM19的mRNA表達(dá)量顯著降低，TIMP1、E-cadherin的mRNA表達(dá)量顯著升高。這就說明新輔助化療能夠調(diào)節(jié)局部晚期宮頸癌病灶內(nèi)多種侵襲基因的表達(dá)，減少促侵襲基因表達(dá)、增殖侵襲抑制基因表達(dá)并阻礙癌細(xì)胞的侵襲過程。

綜上所述，術(shù)前新輔助化療能夠抑制宮頸癌病灶內(nèi)促增殖分子及促侵襲基因的表達(dá)，促進(jìn)抑癌基因及侵襲抑制基因的表達(dá)，具有積極的臨床應(yīng)用價值。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

劉志文、馮慧芳：研究方案設(shè)計，論文撰寫，實(shí)施研究；夏麗偉：論文審核；吳又明、林曉嵐：統(tǒng)計學(xué)分析