達(dá)瑪烷苷元抑制IKKβ— NF—κB信號通路預(yù)防煙草誘發(fā)肺癌有效性的研究

吳瑾　劉丹　楊玉光　周紅鳳　胡曉薇　劉文濤

摘 要：研究達(dá)瑪烷苷元通過抑制IKKβ- NF-κB信號通路預(yù)防煙草誘發(fā)的肺癌。方法 選取昆明種小鼠分為對照組和達(dá)瑪烷苷元不同劑量干預(yù)組建立模型，監(jiān)測達(dá)瑪烷苷元對小鼠血清中炎癥因子水平、對IKKβ- NF-κB信號通路、對IKKβ- NF-κB信號通路下游抗凋亡相關(guān)蛋白、對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的影響。結(jié)果 干預(yù)組計(jì)數(shù)肺表面的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和形態(tài)、顏色、大小等，可見腫瘤控制情況良好。TNF-α等炎性因子、抗凋亡蛋白、IKB激酶、ICAM-1的測定，干預(yù)組較對照組明顯，且P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論達(dá)瑪烷苷元通過抑制IKKβ- NF-κB信號通路預(yù)防煙草誘發(fā)的肺癌的發(fā)生效果明顯，值得臨床廣泛推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：達(dá)瑪烷苷元；IKKβ-；NF-κB信號通路；肺癌

惡性腫瘤是人類健康的殺手，業(yè)已成為常見病、多發(fā)病，達(dá)瑪烷苷元在治療腫瘤的臨床應(yīng)用上取得了一定成績[1]，得到了國際腫瘤醫(yī)學(xué)界的廣泛認(rèn)可。本文從其上游炎癥因子和下游蛋白表達(dá)的角度研究了達(dá)瑪烷苷元通過如何抗炎途徑來預(yù)防肺癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下：

1材料與方法

1.1試劑與材料

達(dá)瑪烷苷元（徐州市達(dá)瑪烷苷元注射劑；2017021001）氯化鈉注射液（哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司；2017101021）ELISA試劑盒（AIPUINS；33363319146）；昆明種小鼠（20-25g）。

1.2方法

1.2.1模型建立。選取昆明種小鼠分為幾組（對照組和達(dá)瑪烷苷元不同劑量干預(yù)組），分別暴露于煙草煙霧的動式染毒柜中，每天6個小時，每周5天，連續(xù)暴露5個月，恢復(fù)4個月之后處死，進(jìn)行形態(tài)學(xué)和病理學(xué)診斷及氧化指標(biāo)檢測，比較各組間差異。

1.2.2達(dá)瑪烷苷元對小鼠血清中炎癥因子水平的影響。采用ELISA方法對不同組別中小鼠血清中TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、和IL-10水平進(jìn)行測定。

1.2.3達(dá)瑪烷苷元對IKKβ- NF-κB信號通路的影響。用原位雜交法和免疫組化檢測肺組織IKB激酶mRNA（IKKβ mRNA）及核轉(zhuǎn)錄因子（NF—κB）P65亞基活性。

1.2.4達(dá)瑪烷苷元對IKKβ- NF-κB信號通路下游抗凋亡相關(guān)蛋白的影響。采用Western-blot方法檢測達(dá)瑪烷苷元對抗凋亡蛋白Survivin（生存素）、CLAPS-1、2、XIAPS、Bcl-2、Bcl-XL的影響并且采用RT-PCR對其mRNA進(jìn)行測定。

1.2.5達(dá)瑪烷苷元對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的影響。采用ELISA方法檢測細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）和內(nèi)皮白細(xì)胞粘附分子（ELAM-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9及MMP-2、尿激酶型纖溶酶激活物（uPA） 。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，定量資料以（ ）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，定性資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1模型驗(yàn)證

2.2.1 肺癌模型。在動式染毒柜中采取動式吸入染毒，控制11%和89%的主側(cè)流煙霧，控制總懸浮微粒（TSP）[2]濃度為119 mg·m-3，并監(jiān)測CO、CO2 及O2 含量。以TSP 和CO含量為吸煙暴露指標(biāo)。染毒5 d∕周，6 h∕d，連續(xù)5個月，恢復(fù)4個月。將清潔級昆明系小鼠250只，隨機(jī)分為5個組。正常對照組，動物不加任何干預(yù)；干預(yù)組高、中、低劑量達(dá)瑪烷苷元，染毒方式同上，給藥9個月。

2.2.2 病理學(xué)診斷。染毒實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠用過量的戊巴比妥殺死，手術(shù)切除全肺，0.9 %生理鹽水清洗，隨即抽取部分小鼠的全肺組織，并用Tellyesniczky 固定液肺臟灌注，之后置于Tellyesniczky 固定液中至少24 h，移至70%酒精中。解剖并計(jì)數(shù)肺表面的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和形態(tài)、顏色、大小等，編號、拍照。

2.2ELISA方法測定TNF-α等炎性因子：

雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法，分別測定各組小鼠血清中TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、和IL-10水平。干預(yù)組較對照組明顯，且P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 IKB激酶mRNA（IKKβ mRNA）及NF—κB P65亞基活性的測定：右下肺固定部位組織塊IKKβ、mRNA 的檢測，干預(yù)組較對照組明顯，且P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4Survivin等抗凋亡蛋白的測定：

Westernblot檢測Survivin及XIAP的表達(dá)，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)分析，干預(yù)組較對照組明顯，且P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以與β-actin的灰度比值表示Survivin和XIAP表達(dá)的相對強(qiáng)度比較，干預(yù)組較對照組明顯，且P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5ICAM-1等腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子水平的測定

采用ELISA方法檢測小鼠血清中細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）和內(nèi)皮白細(xì)胞粘附分子（ELAM-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9及MMP-2、尿激酶型纖溶酶激活物（uPA），測定結(jié)果干預(yù)組較對照組明顯，且P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.討論

吸煙可能提高肺癌的易感性已經(jīng)成為大家都接受的共識，究竟吸煙如何影響肺癌的發(fā)生人們卻不得而知，本文研究了煙草導(dǎo)致小鼠肺癌發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，以IKKβ- NF-κB信號通路作為主要研究靶點(diǎn)，研究結(jié)果將為肺癌的預(yù)防（尤其是吸煙導(dǎo)致的肺癌）和治療提供新的思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]熊非，劉健，李燦，等.應(yīng)用納米技術(shù)發(fā)展血液惡性腫瘤檢測與治療的新技術(shù)和新方法[J].中國基礎(chǔ)科學(xué)，2016，18（3）：11-12.

[2]張菊. TSP-1及其受體CD47在百草枯中毒大鼠肺纖維化模型中的作用及機(jī)制初步探討[D].川北醫(yī)學(xué)院，2016.

項(xiàng)目名稱：達(dá)瑪烷苷元通過抑制IKKβ- NF-κB信號通路預(yù)防煙草誘發(fā)的肺癌的研究。

項(xiàng)目編號：ZHY10-288，資助單位：黑龍江省中醫(yī)藥管理局。

責(zé)任作者：吳瑾女 1963年12月生人教授哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院。