小麥鉀離子通道蛋白基因 TaAKT1的功能分析

畢惠惠，毛偉偉，李海霞，程西永，周渭皓，周思遠(yuǎn)，武會芳，許海霞

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)/省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450046)

小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一，約40%的人口以小麥為主糧[1]。我國耕地普遍存在缺鉀現(xiàn)象[2]，缺鉀會引起小麥的產(chǎn)量下降，品質(zhì)劣化，耐逆性減弱，嚴(yán)重威脅我國糧食安全[3-5]。鉀離子通道蛋白在植物吸收外界鉀離子過程中發(fā)揮重要作用，植物中的鉀離子通道蛋白主要包括兩類：非電壓門控通道蛋白和電壓門控通道蛋白[6]。非電壓門控通道蛋白的活性不受膜兩側(cè)電勢差控制，其大部分成員可以與鈣離子結(jié)合，活性直接受鈣離子調(diào)控[7-8]。電壓門控通道又稱Shaker-type通道，其蛋白活性受膜兩側(cè)電勢差控制[9]。植物的Shaker-type通道蛋白在序列和結(jié)構(gòu)上相似性較高，而且和動物的Shaker通道蛋白也有一定的相似性[10]。Shaker-type通道蛋白由四個亞基組成，每個亞基包含6個跨膜區(qū)域，第2個跨膜區(qū)域?yàn)殡妷焊惺芷?；?、6跨膜結(jié)構(gòu)域之間形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有保守序列TxxTxGYGD，能選擇性結(jié)合鉀離子[11-12]。最早被克隆的植物Shaker-type通道蛋白是擬南芥AtAKT1，屬于內(nèi)流鉀離子通道蛋白[13]。Hirsch等[14]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtAKT1可以介導(dǎo)擬南芥對土壤中的鉀離子吸收。Xu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Atakt1基因突變體的鉀離子吸收效率顯著下降，在低鉀脅迫條件下，突變體的長勢明顯劣于野生型，且表現(xiàn)出葉片黃化等缺鉀病癥；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AtCIPK23 可以使 AtAKT1 磷酸化，激活 AtAKT1 的鉀離子吸收功能。此外，研究表明，在低鉀條件下，擬南芥Atakt1突變體的主根較野生型的長，是由于野生型擬南芥生長素積累的減少導(dǎo)致的[16]。龍 雨[17]的研究表明，水稻OsAKT1基因主要在根的表皮和維管組織中表達(dá)，Osakt1基因突變體表現(xiàn)出明顯的低鉀敏感表型；并在爪蟾卵母細(xì)胞中驗(yàn)證了OsAKT1的鉀離子吸收活性受上游OsCBL1-OsCIPK23的調(diào)控。李 娟[18]在鉀缺陷型酵母中驗(yàn)證了OsAKT1具有鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性。以上研究結(jié)果說明，AKT1具有轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子的功能，并且其功能受CIPK23調(diào)控而增強(qiáng)；并且AKT1基因與植物的生長發(fā)育具有密切的關(guān)系。

鉀離子通道蛋白在植物鉀離子吸收過程中起著重要作用，但是目前對小麥鉀離子通道蛋白的功能研究較少，尤其是小麥TaAKT1的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能及相關(guān)的調(diào)控模式未見報(bào)道。本研究通過克隆小麥TaAKT1基因，研究其在低鉀脅迫條件下的表達(dá)情況及在小麥中的表達(dá)特異性，利用酵母突變體鑒定TaAKT1基因的功能以及TaCIPK23基因?qū)aAKT1基因的調(diào)控作用，以期為小麥鉀離子調(diào)控機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料及處理

以普通小麥(TriticumaestivumL.)品種石4185為試驗(yàn)材料，對其種子表面進(jìn)行滅菌處理：70%酒精浸泡4 min，無菌蒸餾水洗滌3次。將種子置于發(fā)芽盒內(nèi)，室溫條件下培養(yǎng)2 d，使其發(fā)芽。將長勢一致的種子移入1/2 Hoagland營養(yǎng)液中，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；設(shè)定培養(yǎng)箱參數(shù)為：溫度23 ℃，光暗周期16/8 h，光子通量密度250 μmol·m-2·s-1。當(dāng)小麥幼苗生長到兩葉一心時(shí)，將幼苗移入鉀離子濃度為50 μmol·L-1的1/2 Hoagland營養(yǎng)液中，分別在處理0、6、12、24和48 h后，采集植株的根與葉。收集材料時(shí)，用無菌蒸餾水充分沖洗，用濾紙吸干水分，立即放入液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，以上各樣品均進(jìn)行三個生物學(xué)重復(fù)。

1.1.2 菌株及載體

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、WΔ3菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。釀酒酵母菌株WΔ3(MATα, ade2, ura3, trp1, trk1Δ::LEU2, trk2Δ::HIS3)缺失了高親和鉀離子吸收載體TRK1與TRK2，在低于10 mmol·L-1KCl的AP培養(yǎng)基上生長受阻，WΔ3為營養(yǎng)缺失型突變體菌株，不能合成腺嘌呤(Adenine)、尿嘧啶(Uracil)和色氨酸(Trp)?？寺≥d體pMD19-T購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。pYPGE15和p414酵母高效表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存，其中pYPGE15可以編碼磷酸甘油酸激酶(PGK1)啟動子、氨芐青霉素(Amp)和尿嘧啶(Uracil)基因；p414可以編碼Trp基因。

1.1.3 主要試劑

DNA聚合酶KOD Plus Neo購于東洋紡(上海)生物科技有限公司，l kb DNA Ladder和dNTP購自天根生化科技(北京)有限公司，小量質(zhì)粒提取試劑盒購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司，DNA限制性內(nèi)切酶購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，Trizol提取液購于上海英駿生物技術(shù)有限公司，T4連接酶和熒光定量試劑GoTaq○RqPCR Master Mix購于普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，氨芐青霉素、膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購于生工生物工程(上海)股份有限公司，感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)均購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。試驗(yàn)中使用的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列分析由生工生物工程(武漢)股份有限公司進(jìn)行。其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

采用Trizol法提取小麥總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并用超微量紫外可見分光光度計(jì)(NanoDrop 2000C，Thermo-Fisher)檢測RNA的濃度和質(zhì)量。利用cDNA合成試劑盒，按照說明書進(jìn)行cDNA合成。

1.3 TaAKT1基因的克隆

根據(jù)小麥TaAKT1(GenBank登錄號AF207745.1)序列信息，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，使用KOD Plus Neo聚合酶克隆TaAKT1基因。PCR體系與程序參考說明書，其中循環(huán)數(shù)為30，退火溫度為68 ℃，延伸時(shí)間為3 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收，并進(jìn)行+A處理，產(chǎn)物純化后連接pMD19-T載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑取陽性單克隆，測序鑒定。測序正確的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，-20 ℃保存。

1.4 TaAKT1蛋白的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy-ProtParam-(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測TaAKT1蛋白的理化性質(zhì)；利用CBS-TMHMM 2.0 Server /(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)進(jìn)行氨基酸序列的跨膜區(qū)分析；利用ExPASy-PROSITE(http://prosite.expasy.org/)預(yù)測TaAKT1蛋白的結(jié)構(gòu)域；從GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)下載植物鉀離子通道蛋白序列，由DNAMAN 5.0軟件完成多序列比對，并利用MEGA 6.0繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 TaAKT1基因表達(dá)模式分析

根據(jù)小麥β-Actin、TaAKT1基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)，使用GoTaq○RqPCR Master Mix，在BIO-RAD CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系與程序參照試劑盒說明書，其中循環(huán)數(shù)為40，退火溫度為58 ℃。每個樣品重復(fù)3次，均做3個平行管。利用公式2-ΔΔCt計(jì)算相對表達(dá)量，分析TaAKT1基因表達(dá)的組織特異性及低鉀脅迫條件下的表達(dá)模式。

1.6 酵母表達(dá)載體構(gòu)建及TaAKT1基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

以含有目的基因的質(zhì)粒DNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，擴(kuò)增含XbaⅠ與SalⅠ酶切位點(diǎn)的TaAKT1基因開放閱讀框序列。用XbaⅠ與SalⅠ酶切TaAKT1基因擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行膠回收，將擴(kuò)增產(chǎn)物連入pYPGE15載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，構(gòu)建酵母表達(dá)載體pYPGE15-TaAKT1。對pYPGE15-TaAKT1進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，并測序。

用PEG熱激法[19]，將空載體pYPGE15和pYPGE15-TaAKT1分別轉(zhuǎn)入酵母突變體菌株WΔ3中。pYPGE15載體上含有編碼尿嘧啶(U)的序列，而酵母菌株WΔ3不含有編碼U的序列，因此用不含U的YNB培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)基因酵母菌落。得到陽性酵母菌株后用液體YNB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)至飽和，每個樣本菌液吸取1 mL至新的1.5 mL無菌離心管中，5 000 r·min-1離心1 min；棄上清，用無菌水洗滌兩次后，重懸菌體，調(diào)整菌液濃度至OD600為0.8左右；配制KCl濃度分別為100 mmol·L-1(對照)、5 mmol·L-1和60 μmol·L-1的AP固體培養(yǎng)基。將菌液分別稀釋10、100和1000倍，在每個梯度稀釋液中吸取5 μL菌液，點(diǎn)在含有不同K+濃度的AP固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d，菌斑清晰可見時(shí)照相保存。

1.7 TaCIPK23對TaAKT1的調(diào)控實(shí)驗(yàn)

從小麥中克隆TaCIPK23基因(GenBank登錄號JX243012.1)，構(gòu)建酵母表達(dá)載體p414-TaCIPK23，構(gòu)建方法與載體pYPGE15-TaAKT1類似。用PEG熱激法[19]將pYPGE15、pYPGE15-TaAKT1、p414-TaCIPK23分別轉(zhuǎn)入酵母菌株WΔ3中，酵母互補(bǔ)表型實(shí)驗(yàn)方法同上。配制KCl濃度分別為100 mmol·L-1(對照)、1 mmol·L-1、60 μmol·L-1的AP培養(yǎng)基，取上述飽和菌液的稀釋液點(diǎn)樣于AP培養(yǎng)基上，3 d后照相保存。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

下劃線部分為酶切位點(diǎn)。

The underlined sequences indicate the sites of restriction enzymes.

2 結(jié)果與分析

2.1 TaAKT1基因的克隆和序列分析

根據(jù)TaAKT1基因的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，以普通小麥品種石4185的cDNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增得到一個2 800 bp左右的條帶，與預(yù)期片段大小一致(圖1)。將擴(kuò)增片段膠回收后，連接pMD19-T載體，送至生工生物工程(武漢)股份有限公司測序，測序結(jié)果與目的序列一致。

M：1 kb ladder；1：TaAKT1擴(kuò)增產(chǎn)物。

M: 1 kb ladder; 1: PCR product ofTaAKT1.

圖1TaAKT1基因的擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.1PCRamplificationofTaAKT1

利用ProtParam預(yù)測TaAKT1蛋白的基本特征，結(jié)果顯示TaAKT1包含897個氨基酸，相對分子質(zhì)量為100.92 kDa，等電點(diǎn)為7.63，不穩(wěn)定系數(shù)為42.45，屬于穩(wěn)定蛋白；利用TMHMM 2.0 Server 進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明TaAKT1包含5個跨膜結(jié)構(gòu)域，C末端較長，從第311個氨基酸到第897個氨基酸，均為親水性氨基酸序列。利用 PROSITE預(yù)測TaAKT1蛋白的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)TaAKT1的CNBD(環(huán)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域)位于第391～497氨基酸位點(diǎn)之間，錨定重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域位于第545～723氨基酸位點(diǎn)之間，KHA(富含疏水和酸性氨基酸)結(jié)構(gòu)域位于819～897氨基酸位點(diǎn)之間(圖2)。

利用MEGA 6.0軟件根據(jù)鄰接法(neighbor-joining, NJ)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，小麥TaAKT1與Shaker-type通道蛋白成員大麥、粗山羊草、二穗短柄草和水稻的AKT1親緣關(guān)系較近，而與非電壓門控通道蛋白水稻OsKCO1和大麥HvKCO1關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。多序列比對結(jié)果顯示，TaAKT1蛋白與大麥HvAKT1、二穗短柄草BdAKT1、玉米ZmAKT1、水稻OsAKT1和擬南芥AtAKT1同源性分別為97.22%、86.50%、79.16%、76.03%和60.55%，而且它們都具有鉀離子通道蛋白的特征序列TxxTxGYGD(圖4)。

2.2 TaAKT1基因的表達(dá)模式

利用qRT-PCR對TaAKT1基因的組織表達(dá)特異性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，TaAKT1在小麥根部的相對表達(dá)量較高(1.00)，約為葉部相對表達(dá)量(0.21)的5倍。

利用qRT-PCR對TaAKT1基因響應(yīng)鉀離子饑餓進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，在低鉀環(huán)境下小麥根部TaAKT1的表達(dá)量基本呈現(xiàn)先升高，后下降的趨勢；低鉀處理6 h后，TaAKT1的表達(dá)量最高，約為初始表達(dá)量的5倍；12 h后，表達(dá)量急劇下降，但仍高于初始表達(dá)水平；第24 h和48 h的表達(dá)量接近初始表達(dá)水平(圖5A)。而葉部TaAKT1的表達(dá)量無明顯差異(圖5B)。

圖2 TaAKT1蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.2 Domain prediction of TaAKT1

Aet：Aegilopstauschiisubsp.Tauschii; Ta:Triticumaestivum; Hv:Hordeumvulgare; Bd:Brachypodiumdistachyon; Os:Oryzasativa; At:Arabidopsisthaliana; Zm:Zeamays.

圖3TaAKT1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

Fig.3PhylogenicrelationshipofTaAKT1andotherpotassiumchannelproteins

A:TaAKT1(Triticumaestivum, GenBank: AAF36832.1); B:HvAKT1 (Hordeumvulgare, GenBank: ABE99810.1); C:BdAKT1 (Brachypodiumdistachyon, GenBank: XP_003569453.1); D:OsAKT1 (Oryzasativa, GenBank: P0C550.1); E:ZmAKT1 (Zeamays, GenBank: XP_008675279.1); F:AtAKT1 (Arabidopsisthaliana, GenBank: NP_180233.1).加框部分為鉀離子通道的特征序列TxxTxGYGD(The potassium ion channel characteristic sequence is in box).

圖4AKT1蛋白多序列比對

Fig.4MultiplesequencealignmentofAKT1protein

圖5 低鉀環(huán)境下小麥根部(A)和葉部(B)TaAKT1基因的相對表達(dá)量Fig.5 Expression level of TaAKT1 gene in root (A) and leaf (B) under low-potassium conditions

2.3 TaAKT1基因的表達(dá)載體及鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能

構(gòu)建酵母表達(dá)載體 pYPGE15-TaAKT1，將表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切和測序鑒定，顯示載體構(gòu)建正確(圖6)。利用PEG熱激法將pYPGE15和pYPGE15-TaAKT1分別轉(zhuǎn)入酵母突變體菌株WΔ3，利用營養(yǎng)缺失法篩選出陽性轉(zhuǎn)基因酵母。

酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在含100 mmol·L-1KCl的AP培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)TaAKT1基因與轉(zhuǎn)空載體pYPGE15的酵母長勢一致(圖7)。在含5 mmol·L-1KCl的AP培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)空載體酵母長勢明顯受到抑制，而轉(zhuǎn)TaAKT1基因酵母菌株生長幾乎不受影響。當(dāng)AP培養(yǎng)基中KCl濃度降至60 μmol·L-1時(shí)，轉(zhuǎn)TaAKT1基因的酵母與轉(zhuǎn)空載體的酵母都不能生長。說明TaAKT1基因能部分恢復(fù)WΔ3菌株的鉀離子吸收能力。

1：pYPGE15-TaAKT1質(zhì)粒；2：pYPGE15-TaAKT1雙酶切；M：1 kb ladder。

1: pYPGE15-TaAKT1 plasmid; 2: Digested products of pYPGE15-TaAKT1 with restriction enzymes; M: 1 kb ladder.

圖6pYPGE15-TaAKT1的雙酶切檢測

Fig.6IdentificationofpYPGE15-TaAKT1digestedwithrestrictionenzymes

A：轉(zhuǎn)pYPGE15的酵母；B、C：轉(zhuǎn)pYPGE15-TaAKT1的酵母。

A:WΔ3transformed with pYPGE15; B, C:WΔ3transformed with pYPGE15-TaAKT1.

圖7轉(zhuǎn)TaAKT1基因的酵母表型驗(yàn)證

Fig.7PhenotypicidentificationofWΔ3transformedwithTaAKT1

2.4 TaCIPK23對TaAKT1的調(diào)控作用

為了探究TaAKT1基因的調(diào)控途徑，構(gòu)建了酵母表達(dá)載體p414-TaCIPK23。雙酶切(圖8)和測序結(jié)果顯示，載體構(gòu)建正確。將p414-TaCIPK23和pYPGE15-TaAKT1共同轉(zhuǎn)入酵母突變體菌株WΔ3，用含100 mmol·L-1KCl的AP培養(yǎng)基為對照，觀察轉(zhuǎn)基因酵母分別在含100 mmol·L-1KCl、1 mmol·L-1KCl和60 μmol·L-1KCl的AP培養(yǎng)基上的表型。在含100 mmol·L-1KCl的AP培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)空載體pYPGE15、轉(zhuǎn)TaAKT1基因、轉(zhuǎn)TaCIPK23+TaAKT1基因的三種菌株長勢一致(圖9)，隨著AP培養(yǎng)基中K+濃度降低，菌株的生長受到抑制。當(dāng)AP培養(yǎng)基中KCl濃度降為1 mmol·L-1時(shí)，轉(zhuǎn)空載體的酵母菌株受影響最大，不能生長；而轉(zhuǎn)TaAKT1的酵母突變體菌株生長嚴(yán)重受抑制；轉(zhuǎn)TaCIPK23+TaAKT1的菌株受影響較??；在含60 μmol·L-1KCl的AP培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)空載體與轉(zhuǎn)TaAKT1基因的酵母菌株均不能生長，轉(zhuǎn)TaCIPK23+TaAKT1基因菌株可以生長。前期的實(shí)驗(yàn)證明單獨(dú)的TaCIPK23不具備鉀離子吸收能力，因此，推測 TaCIPK23具有促進(jìn)TaAKT1鉀離子吸收的作用。

M：1 kb ladder；1和2：p414-TaCIPK23的雙酶切結(jié)果。

M: 1 kb ladder; 1 and 2:Digestion of p414-TaCIPK23by restriction enzymes.

圖8p414-TaCIPK23的雙酶切驗(yàn)證

Fig.8Identificationofp414-TaCIPK23digestedwithrestrictionenzymes

A：轉(zhuǎn)pYPGE15的酵母；B：轉(zhuǎn)pYPGE15-TaAKT1的酵母；C：轉(zhuǎn)pYPGE15-TaAKT1和p414-TaCIPK23的酵母。

A:WΔ3transformed with pYPGE15; B:WΔ3transformed with pYPGE15-TaAKT1; C:WΔ3transformed with both pYPGE15-TaAKT1 and p414-TaCIPK23.

圖9TaCIPK23、TaAKT1共表達(dá)酵母表型

Fig.9PhenotypicidentificationofWΔ3transformedwithbothTaAKT1andTaCIPK23

3 討 論

近年來，隨著我國糧食產(chǎn)量和復(fù)種指數(shù)的提高，土壤中鉀離子含量在不斷下降[2]，缺鉀使小麥的產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降，嚴(yán)重制約我國糧食生產(chǎn)[3-5]。培育鉀高效利用小麥品種，是解決上述問題的有效途徑。從分子角度研究小麥的鉀離子吸收機(jī)制，可以為鉀高效利用小麥的培育提供理論依據(jù)。本研究利用qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，小麥鉀離子通道蛋白基因TaAKT1響應(yīng)低鉀脅迫，酵母功能互補(bǔ)結(jié)果表明TaAKT1具有轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子的功能，TaCIPK23可能具有增強(qiáng)TaAKT1吸收鉀的作用。對TaAKT1基因功能的初步分析為小麥鉀離子通路的研究奠定了基礎(chǔ)。生物信息學(xué)分析是蛋白結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測的有效手段[20]，利用此方法，我們發(fā)現(xiàn)小麥TaAKT1蛋白與大麥HvAKT1、粗山羊草AetAKT1、二穗短柄草BdAKT1、水稻OsAKT1和擬南芥AtAKT1具有較高同源性。HvAKT1[21]和AtAKT1[22]都被證實(shí)具有介導(dǎo)鉀離子吸收能力，因此預(yù)測TaAKT1可能為鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。利用PROSITE對TaAKT1進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示TaAKT1具有CNBD(環(huán)核苷酸結(jié)合域)、錨定重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域和KHA(富含疏水和酸性氨基酸殘基)結(jié)構(gòu)域，符合Shaker-type通道蛋白的基本特征[11]。有活性的Shaker-type通道蛋白都是由四個亞基組成的，環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)域和KHA區(qū)域可能在亞基的聚合過程中發(fā)揮重要作用[23]。錨定重復(fù)序列結(jié)構(gòu)的存在說明該蛋白可與其他蛋白互作，活性可受到其它蛋白的調(diào)節(jié)。Véry和 Sentenac[11]指出，Shaker-type 通道蛋白亞基由6個跨膜區(qū)域組成，本研究利用TMHMM 2.0 Server軟件對植物的Shaker-type的AKT1亞家族進(jìn)行了跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)大部分AKT1都包含5個跨膜結(jié)構(gòu)，如小麥TaAKT1、水稻OsAKT1、擬南芥AtAKT1和二穗短柄草BdAKT1等，可能是第三跨膜區(qū)域較短的緣故。

對TaAKT1基因的表達(dá)模式研究表明，正常條件下，小麥TaAKT1基因主要在根部表達(dá)，其表達(dá)量是葉部的5倍，說明TaAKT1基因的表達(dá)具有組織特異性，這一結(jié)果與大麥HvAKT1基因相似[21]。低鉀使小麥根部的TaAKT1基因上調(diào)表達(dá)，而對葉部TaAKT1基因的表達(dá)量無顯著影響?？赡苁怯捎诟侵苯咏閷?dǎo)鉀離子吸收的器官，最先與鉀離子接觸，因此易受缺鉀影響。Pilot[22]等通過實(shí)驗(yàn)證明擬南芥根部和葉部的AtAKT1基因表達(dá)都不受低鉀誘導(dǎo)，而本研究發(fā)現(xiàn)小麥根部TaAKT1基因表達(dá)受低鉀誘導(dǎo)，說明小麥TaAKT1基因與擬南芥AtAKT1基因表達(dá)模式不同。

酵母是最早完成測序的真核生物，由于其具有遺傳背景簡單、易于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)周期短、易獲得突變體等特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于外源基因功能的研究。目前，人們對酵母離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理研究的較為透徹，已通過基因工程技術(shù)，獲得了許多離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能缺失突變體，這些突變體為植物Na+、K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的鑒定提供了便利[24]。本研究利用酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TaAKT1能介導(dǎo)鉀離子吸收，可以部分恢復(fù)酵母突變體WΔ3的高親和鉀離子吸收能力，但這種恢復(fù)能力有限。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TaCIPK23具有調(diào)控TaAKT1的作用，在低鉀環(huán)境下，可以增強(qiáng)TaAKT1介導(dǎo)鉀離子吸收的能力。這與其他植物有關(guān)AKT1功能的報(bào)道是一致的。在擬南芥中AtAKT1受到AtCBL1/AtCIPK23或AtCBL9/AtCIPK23復(fù)合體激活能增強(qiáng)對鉀的吸收[15]。Boscari[21]通過在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)AtCBL1或AtCBL9與AtCIPK23同時(shí)存在的條件下可以激活大麥的HvAKT1的鉀離子通道蛋白活性。而本研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的TaCIPK23可以增強(qiáng)小麥TaAKT1的鉀離子吸收活性，但是，在TaCBLs的存在下，這種鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力能否進(jìn)一步增強(qiáng)，小麥中CBLs和CIPK23互作對TaAKT1的調(diào)控等，都需要進(jìn)一步研究。