微生物去除土壤阿特拉津污染及黃瓜根系的氧化應(yīng)激反應(yīng)

劉丹丹 劉暢

摘要：以莠去津降解菌和硅藻土為試材制備修復(fù)菌劑，通過對菌體存活率的測定，研究菌劑對貯藏時間、溫度和紫外線的耐受能力。同時采用盆栽試驗方法，測定菌劑對莠去津的去除效果，并比較菌劑施用前后黃瓜根部丙二醛（MDA）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）等氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化。結(jié)果表明，菌劑在室溫條件下存放28 d后，菌體存活率仍高達(dá)83%，對高溫和紫外線照射也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性。盆栽試驗中，菌劑施用28 d后，莠去津的去除率最高，接近80%。氧化應(yīng)激指標(biāo)變化表明，菌劑能夠減少黃瓜根部MDA積累，提高POD、PPO和SOD活性。不難看出，以硅藻土為載體的修復(fù)菌劑性狀良好，不僅能夠高效去除土壤中的莠去津殘留，還能減輕莠去津?qū)γ舾凶魑锏膫ψ饔谩?/p>

關(guān)鍵詞：莠去津;黃瓜;生物修復(fù);環(huán)境脅迫;PPO;SOD;POD;MDA

中圖分類號： X592 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0307-03

莠去津是在世界范圍內(nèi)都有廣泛應(yīng)用的除草劑，應(yīng)用后在環(huán)境中持久存在，且具有毒性[1]。它在環(huán)境中的高殘留常對其他作物造成毒害，帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。在治理莠去津污染的過程中，生物修復(fù)以成本低廉、操作簡便、處理效果好和無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，成為眾多治理方法中的首選[3]。但生物修復(fù)方法的應(yīng)用，受環(huán)境條件限制，如溫度、光照、水分、pH值和土壤性質(zhì)等，均能影響污染修復(fù)效果[4]。選擇合適的載體材料，制成生物修復(fù)菌劑技術(shù)，不僅能夠提高菌體對不良環(huán)境條件的抗性，還能保證污染治理效果。硅藻土對環(huán)境友好，成本低，易獲得，亦是常見的載體材料，將其與莠去津降解菌制成修復(fù)菌劑，對莠去津的污染治理具有重要意義。

有研究表明，當(dāng)土壤中莠去津含量超過0.1 mg/kg時，將嚴(yán)重影響敏感作物的生長[5]。黃瓜是常見的蔬菜，其種植面積大，對莠去津敏感。黃瓜抗氧化防御酶活性變化與所處環(huán)境條件密切相關(guān)，其活性的提高可以增強(qiáng)植物對逆境的耐受能力，是降低和修復(fù)逆境傷害的重要生理生化指標(biāo)[6]。了解莠去津脅迫下敏感作物的生理響應(yīng)，對于減輕植物傷害、揭示微生物修復(fù)機(jī)制都有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥劑 莠去津，市售商品，濃度為97%。

1.1.2 供試黃瓜 粵秀3號，市售商品。挑選大小均一的飽滿籽粒，催芽露白后播種，待植株生長至2～3張復(fù)葉時進(jìn)行試驗。

1.1.3 試驗菌株 莠去津降解菌Enterobacter sp.（腸桿菌屬），由沈陽化工大學(xué)環(huán)境科學(xué)實(shí)驗室篩選并保存。菌株采用無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（每1 000 mL含K2HPO4 1.6 g、KH2PO4 0.4 g、MgSO4 0.2 g、NaCl 0.1 g、葡萄糖3 g、莠去津0.1 g）培養(yǎng)24 h，并制成生物量為2×108 CFU/mL的菌液。

1.1.4 載體材料 硅藻土，市售，粒徑為3～6 mm，呈灰白色，經(jīng)121 ℃高壓滅菌30 min，65 ℃烘干備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌劑制備及性能測定 菌劑制備：向硅藻土中噴灑 2×108 CFU/mL 菌液并混勻，用量約為60 mL菌液/100 g硅藻土，制成菌劑，并于廣口瓶中避光保存。存活率測定：28 d后，取0.1 g菌劑放入 100 mL 無菌水中，30 ℃振蕩培養(yǎng)2 h，進(jìn)行平板涂布，測定活菌數(shù)，計算菌體存活率。溫度對菌體存活的影響：在15、25、40、60 ℃條件下，將菌劑放置2、7、14、21、28 d后，振蕩培養(yǎng)，測定菌體存活率。紫外線照射對菌體存活的影響：將菌劑平鋪，放置于紫外燈下（波長312 nm，功率10 W），照射0、20、40、60、80 min，振蕩培養(yǎng)后，測定菌體存活率。各試驗均設(shè)5次重復(fù)，以游離菌為對照。菌體存活率=測得活菌數(shù)/接種細(xì)菌數(shù)×100%。

1.2.2 菌劑對土壤中莠去津的去除與黃瓜根系防御酶活性的測定 取不含莠去津的農(nóng)田表層土壤，過2 mm篩后風(fēng)干備用。土壤做3組處理，即污染土壤（莠去津10 mg/kg）、添加菌劑土壤（按土壤質(zhì)量1%向污染土壤中添加菌劑）和空白對照。將處理好的土壤裝入塑料花盆中，裝土量約200 g/盆，黃瓜4株/盆，在25 ℃培養(yǎng)箱中避光保存，保持土壤含水率在70%左右，0、7、14、28、35 d后，檢測土壤中莠去津殘留量和黃瓜根系防御酶活性。粗酶提取參考薛應(yīng)龍的方法[7]，丙二醛（MDA）含量測定采用Chen等的方法[8]，過氧化物酶（POD）活性測定采用張志良等的方法[9]，多酚氧化酶（PPO）活性測定采用段春梅等的方法[10]，超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用Giannopolitis等的方法[11]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0和Excel 2010統(tǒng)計完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌劑制備和性能測定結(jié)果

硅藻土具有大量微孔，其比表面積大，菌體負(fù)載能力和吸水能力強(qiáng)，并能吸收和分散太陽光，保護(hù)菌體免受不良環(huán)境條件傷害，保證菌體的有效活菌數(shù)。經(jīng)測定，在菌劑制成并存放28 d后，其菌體存活率約為80%。溫度對微生物生命活動的影響很大，直接影響菌劑的施用效果，因此，要考察不同溫度條件下，菌劑中有效活菌數(shù)的變化情況。從菌劑制備完成至存放28 d，菌體存活率情況見表1。由表1可知，在較低溫度 15 ℃ 時，菌劑保存28 d后，檢測其活菌率較高，約為83%;25 ℃ 下，隨著時間延長，活菌率下降，28 d時為80%;在較高溫度40和60 ℃時，菌劑中活菌數(shù)量顯著降低，28 d時分別降至33%和12%。

紫外線具有殺菌能力，細(xì)菌直接暴露在陽光下，其數(shù)量和功能都會降低，而硅藻土的特殊結(jié)構(gòu)可以吸收分散陽光輻射，為細(xì)菌提供保護(hù)場所。本試驗考察了菌劑受不同時間的紫外線照射后，菌體的存活情況。由圖1可知，在相同處理時間，菌劑中的菌體存活率均高于游離菌。紫外線照射 20 min后，菌劑中菌體存活率為92%，對照中游離菌的存活率為78%;紫外線照射80 min后，菌劑中菌體存活率為22%，對照中游離菌的存活率已下降至1.8%。不難看出，以硅藻土為載體制成的莠去津修復(fù)菌劑對紫外線的耐受力較強(qiáng)。

2.2 菌劑對土壤中莠去津的去除效果

由圖2可知，在不同修復(fù)時間，土壤中添加菌劑后莠去津殘留量一直低于不添加菌劑的污染土壤。施入菌劑28 d時，土壤中莠去津含量接近最低，約為2.0 mg/kg，去除率接近80%，而污染土壤中莠去津殘留量仍高達(dá)8.2 mg/kg。

2.3 菌劑對黃瓜根系防御酶的影響

不利的環(huán)境條件會刺激植物產(chǎn)生某些代謝反應(yīng)以降低或修復(fù)逆境帶來的傷害，黃瓜抗氧化防御酶活性的增強(qiáng)，可以提高植物的抗逆性，抗氧化防御酶系被認(rèn)為是其對環(huán)境脅迫響應(yīng)的重要指標(biāo)。在利用修復(fù)菌劑進(jìn)行土壤污染修復(fù)的過程中，檢測不同處理時間下的黃瓜根系MDA含量與POD、PPO、SOD活性。由圖3至圖6可知，在僅含莠去津的污染土壤中，MDA積累量較對照明顯增加，說明黃瓜根系受害嚴(yán)重，添加菌劑后MDA含量有所下降。POD、PPO和SOD活性在不添加菌劑的污染土壤中最低，添加菌劑后，活性均有不同程度的升高，表明黃瓜的傷害狀況得到了一定程度的緩解。

3 討論與結(jié)論

從菌劑制備及其性能測定結(jié)果可以看出，以硅藻土為載體制備的修復(fù)菌劑，在耐貯藏、高溫和紫外線等方面，性能良好，對土壤中的莠去津殘留有較好的修復(fù)效果。

MDA是膜脂過氧化過程中形成的產(chǎn)物，其含量能夠很好地反映細(xì)胞膜損傷程度[12]。POD是植物中廣泛存在的酶，是反映根系活力的重要指標(biāo)。PPO的作用是進(jìn)行去甲基化反應(yīng)，與生長素（IAA）含量和植物根系生長有關(guān)[13]。SOD在清除體內(nèi)活性氧方面有重要作用，可避免植物的傷害作用[14]。對比菌劑施用前后黃瓜根系氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化情況可知，在菌劑處理土壤中，MDA含量降低，POD、PPO和SOD活性都有明顯升高，表明莠去津?qū)S瓜的傷害作用得到了緩解。

參考文獻(xiàn)：

[1]周 寧. 除草劑莠去津污染土壤的植物修復(fù)研究[J]. 北方園藝，2014（6）：166-168.

[2]宋 日，劉 利，馬麗艷，等. 阿特拉津?qū)Σ煌N子大小品種大豆的危害[J]. 中國油料作物學(xué)報，2013，35（2）：207-210.

[3]Fan X X，Song F Q. Bioremediation of atrazine：recent advances and promises[J]. Journal of Soils and Sediments，2014，14（10）：1727-1737.

[4]Zhou X D，Wang Q F，Wang Z，et al. Nitrogen impacts on atrazine-degrading Arthrobacter strain and bacterial community structure in soil microcosms[J]. Environmental Science and Pollution Research，2013，20（4）：2484-2491.

[5]楊彩宏，馮 莉，田興山. 莠去津土壤殘留對4種蔬菜生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響[J]. 中國蔬菜，2016（3）：53-59.

[6]馬兵兵，姜 昭，Kehinde，等. 狼尾草根系對阿特拉津長期脅迫的氧化應(yīng)激響應(yīng)[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2016，11（6）：214-222.

[7]上海植物生理學(xué)會. 植物生理學(xué)實(shí)驗手冊[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1985.

[8]Chen Y S，Wu C F，Zhang H B，et al. Empirical estimation of pollution load and contamination levels of phthalate esters in agricultural soils from plastic film mulching in China[J]. Environmental Earth Sciences，2013，70（1）：239-247.

[9]張志良，瞿偉箐. 植物生理學(xué)實(shí)驗指導(dǎo)[M]. 3版.北京：高等教育出版社，2003.

[10]段春梅，薛泉宏，趙 娟，等. 放線菌劑對黃瓜幼苗生長及葉片PPO活性的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，19（9）：48-54.

[11]Giannopolitis C N，Ries S K. Superoxide dismutases Ⅰ.Occurrence in higher plants[J]. Plant Physiology，1977，59（2）：309-314.

[12]Chiang Y J，Wu Y X，Chiang M Y，et al. Role of antioxidative system in paraquat resistance of tall fleabane （Conyza sumatrensis）[J]. Weed Science，2008，56（3）：350-355.

[13]高桂鳳，王俊玲，楚海嬌. 阿特拉津降解酶的提取及酶活性分析[J]. 北方園藝，2016，40（14）：94-96.

[14]竇俊輝，喻樹迅，范術(shù)麗，等. SOD與植物脅迫抗性[J]. 分子植物育種，2010，8（2）：359-364.