銀杏林土壤放線菌分離鑒定及對植物病原菌的拮抗作用研究

高嫚妮 潘忠成 高波 楊宏勃 陳豪 翁婧 李蒲民

摘?要：

從銀杏樹林土壤中分離放線菌，并用生長速率法測得其對植物病原菌具有拮抗活性，且抑制率達到80.00%以上。杯碟法測量結(jié)果表明菌株MKLFXJ-I發(fā)酵液對9種植物病原菌均具有抑菌活性。通過菌種培養(yǎng)形態(tài)、細胞形態(tài)、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，初步鑒定菌株MKLFXJ-I為鏈霉菌Streptomyces sp.。

關(guān)鍵詞：

放線菌;拮抗作用;生長速率法;鑒定

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191230003

化學(xué)農(nóng)藥制劑長期大量使用促使植物病原菌產(chǎn)生抗藥性的問題已越來越嚴重，同時化學(xué)藥劑會給生態(tài)平衡帶來嚴重的不良影響，因此開發(fā)高效、低毒、綠色的生物農(nóng)藥產(chǎn)品迫在眉睫。近幾年來，利用微生物資源開發(fā)生物藥劑防治病害成為當今研究的熱點[1]，放線菌因分布廣泛、種類多樣，可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)豐富的具有抗菌活性的物質(zhì)，且易降解，環(huán)境相容性好，使其在微生物農(nóng)藥開發(fā)中占據(jù)首要位置[2]。放線菌用于植物病害的防治已有很多報道[3，4]，其中以鏈霉菌的研究最為廣泛和深入，也最具有生防利用價值。Umezawa H[5]等從日本奈良縣春日神社境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的春日鏈霉菌，經(jīng)研究其代謝產(chǎn)物，開發(fā)出了春雷霉素，廣泛應(yīng)用于水稻稻瘟病、黃瓜枯萎病、大白菜黑腐病等多種病害的防治。后來，沈寅初[6]從江西土良地區(qū)也分離到了1株春雷霉素產(chǎn)生菌，命名為小金色鏈霉菌。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所從海南地區(qū)土壤中分離到1株鏈霉菌，后續(xù)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物防治研究所將其開發(fā)成一種生物農(nóng)藥-中生菌素，通過多年田間試驗表明，該抗生素對水稻白葉枯病、大白菜軟腐病、蘋果輪紋病和蘋果早期落葉病等具有良好的防治效果[7，8]。本研究針對從銀杏林土壤中分離得到的放線菌MKLFXJ-I，測定了該菌對植物病原菌拮抗活性及其代謝物的抗菌活性，并對其進行鑒定，以期能獲得結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的先導(dǎo)化合物，為開發(fā)新型生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1?材料

植物病原：蘋果輪紋病菌、蘋果斑點落葉病菌、蘋果褐斑病菌、小麥赤霉病菌、稻瘟病、煙草赤星病菌、蘋果腐爛病菌、水稻白葉枯病菌及柑橘潰瘍病菌，由貴州凱里學(xué)院黔東南民族藥綜合利用工程中心提供。

2?方法

2.1?菌種的分離與純化

從銀杏林取適量土樣，將其自然風(fēng)干，過60目篩。再采用稀釋法，在高氏一號培養(yǎng)基上對菌種進行劃線培養(yǎng)，分離，純化。最后從培養(yǎng)基上挑取單菌落接種到斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3d，置于冰箱4℃保存。

2.2?放線菌拮抗活性測試

在NA培養(yǎng)基上活化柑橘潰瘍病菌和水稻白葉枯病菌，用蒸餾水將其配制成濃度約為106個/mL的細菌菌懸液，分別取100μL加入融化的NA培養(yǎng)基中，混勻，倒皿，制成含菌平皿。在PDA培養(yǎng)基上活化菌株，用打孔器取帶有單菌落的菌餅，將菌餅帶菌絲的一面貼在制好的含病原細菌的培養(yǎng)基表面。每個處理設(shè)3個重復(fù)，置于28℃培養(yǎng)2d，用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

在PDA培養(yǎng)基上活化植物病原真菌（蘋果輪紋病菌、蘋果斑點落葉病菌、蘋果褐斑病菌、小麥赤霉病菌、稻瘟病、煙草赤星病菌、蘋果腐爛病菌），分別將病原真菌制成濃度約為106個/mL的孢子懸液，再分別取100μL孢子懸液與融化的PDA混勻，倒皿。菌餅處理如上，于30℃培養(yǎng)5d，用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

2.3?放線菌液體培養(yǎng)及發(fā)酵濾液抑菌活性測定

將菌株MKLFXJ-I接種在PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d，用無菌蒸餾水洗下孢子懸液，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖20g，玉米粉10g，黃豆粉20g，酵母膏1g，（NH4）2SO4 3g，K2HPO4 0.20g，MgSO4 0.25g，NaCl 3.00g，F(xiàn)eSO4 0.01g，CaCO3 5.00g，蒸餾水1L， pH7.0～7.2），28℃，180rpm/min振蕩培養(yǎng)5 d，4000rpm/min離心，收集上清液。

采用生長速率法[9]?測試發(fā)酵液對真菌活性，把1mL發(fā)酵液（經(jīng)0.22 μm微孔濾膜）與9mL融化的PDA培養(yǎng)基混勻，倒皿，制成含藥平皿。用打孔器分別取病原真菌菌塊，反面接種在含藥平皿上，每個處理設(shè)3次重復(fù)，30℃培養(yǎng)5d，用十字交叉法測量供試菌菌落直徑，計算抑制率。

抑制率（%）=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）]×100

采用杯碟法[10]對菌株MKLFXJ-I發(fā)酵液對柑橘潰瘍病菌和水稻白葉枯病菌的抑菌活性。將其用蒸餾水其配制成濃度約為106個/mL的細菌菌懸液，分別取100μL加入融化的NA培養(yǎng)基中，混勻，倒皿，制成含菌平皿。在含菌平皿上等距放置牛津杯，牛津杯內(nèi)加入250μL發(fā)酵液，每個處理各設(shè)3個重復(fù)。30℃培養(yǎng)20～48h，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

2.4?放線菌MKLFXJ-I菌株鑒定

2.4.1?形態(tài)觀察與培養(yǎng)特征

采用插片法[11]，將菌株接種在高氏一號培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5～7d，參考閻遜初[12]所用的方法，進行光學(xué)顯微鏡20倍下觀察菌株基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲的形態(tài)特征。參照《鏈霉菌鑒定手冊》[13]，觀察菌株MKLFXJ-I在8種不同培養(yǎng)基上的生長特性。

2.4.2?生理生化特征檢測

參考文獻[12]的方法，對菌株的生理生化特征進行測定，具體分析菌株MKLFXJ-I對不同碳源和不同氮源利用、對硝酸鹽的還原、對牛奶的影響以及是否產(chǎn)酪氨基酸酶和淀粉酶等。

2.4.3?16S rRNA基因序列分析

2.4.3.1?DNA提取

用DNA試劑盒提取菌株MKLFXJ-I的DNA。具體包括：菌株在高氏一號培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d，收集菌絲;向菌體沉淀中加入200μL緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮;向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混勻;加入220μL緩沖液GB，振蕩15s，70℃放置10min，溶液變的清亮，簡短離心以除去管蓋內(nèi)壁的水珠;加220μL無水乙醇，充分振蕩混勻15s，此時出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以除去管蓋內(nèi)壁的水珠;將上一步所得溶液和絮狀沉淀加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中;向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中;向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中;將吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液;將吸附柱CB3放入干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加60μL洗脫緩沖液TE，室溫放置數(shù)分鐘，12000rpm離心2 min，將溶液收集到離心管中（-20 ℃冰箱保存）。

2.4.3.2?聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增反應(yīng)

采用細菌16S通用引物[14]進行16S rDNA PCR擴增，擴增條件見表1。

PCR反應(yīng)流程為：95℃預(yù)變性3min后，進行30個循環(huán)，每一個循環(huán)包括95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，以保證獲得全長產(chǎn)物。

2.4.3.3?瓊脂糖凝膠的制備

配濃度為1%的膠（30mL 1×TBE緩沖液，0.3g瓊脂糖），加熱至瓊脂糖溶化，混勻;

在制膠槽上放上制膠板，調(diào)整水平插上樣品梳子;

把瓊脂糖溶液倒入膠板中，加入3 μL的4s-Green核酸染料溶液，充分混勻，注意避免氣泡產(chǎn)生;

在凝膠完全凝固后，拔下梳子。

2.4.3.4?DNA樣品檢測

將凝膠放入電泳槽中，電泳緩沖液要沒過凝膠;

取樣品5μL，加入樣品槽中;

連接電泳儀的正負極，用120V的穩(wěn)定電壓進行電泳，計時20min;

將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中掃描，觀察DNA條帶，并拍攝照片;

將目的條帶膠回收，樣品由中科院微生物研究所測序。

2.4.3.5?系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

先將測得的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST相似性分析，再從GenBank中獲得和實驗菌株序列相似的種屬的16S rDNA序列22株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

3?結(jié)果與分析

3.1?放線菌分離

采用劃線法從銀杏林土壤中分離得到1株放線菌，公司將其命名為MKLFXJ-I。

3.2?菌株皿內(nèi)拮抗活性

由表2可知，菌株MKLFXJ-I對9種供試病原菌生長均具有不同程度的抑制作用，其中對柑橘潰瘍病菌和水稻白葉枯病菌的抑制圈直徑分別為15.52±0.12mm和8.06±0.22mm;對蘋果輪紋病菌、蘋果斑點落葉病菌、蘋果褐斑病菌、小麥赤霉病菌、稻瘟病、煙草赤星病菌、蘋果腐爛病菌的抑菌透明圈均在10cm以上。

3.3?菌株發(fā)酵液抑菌活性測試

由表3可知，菌株發(fā)酵原液對7種供試植物病原真菌菌絲生長具有不同程度的抑制作用，對蘋果腐爛病菌和蘋果斑點落葉病菌的抑制率達到了98%以上，對其它病原菌的抑制率均大于60%;由表4可知對柑橘潰瘍病菌和水稻白葉枯病菌均具有抑制作用，抑菌圈直徑平均值分別為35.23±1.34mm和22.45±0.98mm。

3.4?形態(tài)特征

菌株MKLFXJ-I在高氏一號培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7d，氣生菌絲為白色;基內(nèi)菌絲為豆汁黃色;孢子絲直、柔曲、鉤狀、螺旋形;孢子柱形、橢圓形。

3.5?培養(yǎng)特征

結(jié)果見表5，菌株在8中不同培養(yǎng)基上均不產(chǎn)可溶性色素，氣生菌絲白色或無色，基內(nèi)菌絲淺黃、白色、棕黃或棕色。

3.6?生理生化特征

結(jié)果見表6，菌株MKLFXJ-I能利用葡萄糖、甘露糖、甘露醇、乳糖、山梨糖、山梨醇、麥芽糖、鼠李糖、海藻糖、果糖、木糖、核糖、糖原、阿拉伯糖、水楊苷、苦杏仁苷、赤蘚醇、肌醇、甘油、纖維二糖、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉等碳源，不能利用半乳糖、蔗糖、蜜二糖、松三糖、菊糖、棉籽糖、蘋果酸鈉、葡萄糖酸鈉等碳源;能利用賴氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和丙氨酸。不能還原硝酸鹽，可使牛奶凍化，但不凝凍，能產(chǎn)生淀粉酶水解淀粉，產(chǎn)酪氨基酸酶。

3.7?16S rDNA基因序列測定結(jié)果

將測得的16S rDNA序列在NCBI中在線BLAST比對分析，結(jié)果顯示菌株屬于連霉屬放線菌，再從GenBank中獲得和實驗菌株序列相似的種屬的16S rDNA序列22株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。因該菌株與鏈霉屬下面的種16S rDNA序列相似性均較低，因此無法鑒定到種（圖1）。

4?討論

本研究對銀杏林土壤中的放線菌進行分離，并對其進行了皿內(nèi)拮抗試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株對柑橘潰瘍病菌和水稻白葉枯病菌以及7種植物病原真菌均具有較強的拮抗活性，表明菌株在培養(yǎng)基上可產(chǎn)拮抗活性物質(zhì)。

發(fā)酵原液的生物活性測試結(jié)果表明，菌株MKLFXJ-I的發(fā)酵產(chǎn)物對供試植物病原真菌和細菌均有一定程度的抑制作用。其中對蘋果斑點落葉病菌、蘋果輪紋病菌和蘋果腐爛病菌的抑制作用明顯，在農(nóng)藥的開發(fā)和利用方面具有一定的開發(fā)潛力。因此，下一步重點研究將針對該菌株發(fā)酵產(chǎn)物中活性組分的分離、純化和鑒定。

通過對菌株的形態(tài)、培養(yǎng)特征和生理生化特性及分子生物學(xué)的研究，初步鑒定該菌株為鏈霉菌。因為BLAST進行基因序列比對分析，打分相似性最高的為97%，從進化樹分析看，與距離該菌株比較近的菌株打分低，因此無法鑒定到種，由此表明該菌株可能是1個新菌種，因此還有待于采用其它生理生化和分子生物學(xué)手段進一步進行分析。

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作者簡介：

高嫚妮（1988-），女，碩士。研究方向：應(yīng)用微生物及生物醫(yī)藥;

潘忠成（1974-），男，博士。研究方向：應(yīng)用微生物及生物醫(yī)藥。