毛蕊異黃酮抑制壓力超負(fù)荷大鼠心肌肥厚及對(duì)JAK∕STAT 信號(hào)通路的影響

黃璟 成傳訪 李惠波 羅燕華 區(qū)文超

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1心內(nèi)科（廣州心血管疾病研究所），2 超聲科（廣州510260）

心肌肥厚是機(jī)體對(duì)生理和病理狀態(tài)的適應(yīng)反應(yīng)，結(jié)果導(dǎo)致心室重構(gòu)。許多研究已經(jīng)證實(shí)心室重構(gòu)是引起心血管疾病發(fā)生率和死亡率顯著升高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1-2］。因此防治心肌肥厚進(jìn)展到心室重構(gòu)具有重要意義［3］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶∕信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（janus kinase∕signal transducer and activator of transcription，JAK∕STAT）信號(hào)通路在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，它是壓力負(fù)荷激活心肌肥厚的主要信號(hào)通路［4-6］。目前臨床上治療心肌肥厚的藥物有限、效果不佳，不良反應(yīng)較多。傳統(tǒng)中醫(yī)藥為天然成分，具有副作用低、安全、多效的特點(diǎn)，可和西醫(yī)治療有機(jī)結(jié)合［7］。而現(xiàn)今傳統(tǒng)中藥多是配方制劑，成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)并不明確，難以標(biāo)準(zhǔn)化和國(guó)際化。因此尋找高純度、安全、有效的中藥單體逆轉(zhuǎn)心肌肥厚，成為目前國(guó)內(nèi)中醫(yī)藥研究的一大課題。毛蕊異黃酮是從傳統(tǒng)中藥黃芪中提取分離得到的一種主要單體成分，是黃芪提取物的主要有效生物化學(xué)成分之一，在心肌肥厚中的作用尚不明確。本研究探討了毛蕊異黃酮在壓力負(fù)荷大鼠心肌肥厚中的作用，以及對(duì)JAK∕STAT 信號(hào)通路的影響。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，共24 只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 毛蕊異黃酮及DMSO 溶劑（sigma 公司），JAK1、STAT3、β-actin 一抗（CST 公司）。

1.3 分組與處理 大鼠隨機(jī)分為腹主動(dòng)脈縮窄組（TAAC組），TAAC+溶劑對(duì)照組（vehicle組）以及TAAC+毛蕊異黃酮處理組（calycosin組），術(shù)后1 周開(kāi)始腹腔給藥。vehicle組及calycosin組每天分別給予等量溶劑或毛蕊異黃酮［1 mg∕（kg·d），n= 8］。8 周后行超聲心動(dòng)圖、左室有創(chuàng)壓檢查，取心臟組織行Western Blot 檢測(cè)JAK1、STAT3 蛋白表達(dá)量。

1.4 腹主動(dòng)脈縮窄壓力超負(fù)荷心肌肥厚模型制備（TAAC 術(shù)） SD 大鼠稱(chēng)重后腹腔注射10%水合氯醛200～300 mg∕kg 麻醉后固定，醫(yī)用酒精消毒皮膚，縱行開(kāi)腹，于左腎動(dòng)脈上方鈍性分離腹主動(dòng)脈，沿血管走行方向放置直徑0.6 mm 鈍性鋼絲與腹主動(dòng)脈一起結(jié)扎后迅速抽出針頭，使腹主動(dòng)脈形成固定縮窄，關(guān)腹。術(shù)后3 d 內(nèi)予腹腔注射青霉素（18 000 U∕kg）預(yù)防感染。

1.5 超聲心動(dòng)圖檢查 大鼠稱(chēng)重后，10%水合氯醛麻醉（200～300 mg∕kg，腹腔注射），剔除大鼠胸部毛發(fā)。以Philips iE33 超聲診斷儀行超聲心動(dòng)圖檢查。L15-7io術(shù)中探頭，左心室橫切面分別測(cè)量室間隔厚度（IVS）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室后壁厚度（LVPW）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV），并計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.6 左心室有創(chuàng)壓檢測(cè) 大鼠稱(chēng)重后，10%水合氯醛麻醉（200～300 mg∕kg，腹腔注射），切開(kāi)頸部皮膚并暴露右頸動(dòng)脈，PE50 導(dǎo)管行右頸動(dòng)脈插管至左心室，Powerlab 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)（ADIn-struments，澳大利亞）記錄心室壓力波形，Labchart Pro（AD-Instruments，澳大利亞）分析左心室收縮末壓（LVSP）、舒張末壓（LVEDP）及心室內(nèi)壓最大上升或下降速率（±dp∕dt max）。

1.7 左心室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）測(cè)定 電子天平測(cè)量空腹大鼠體質(zhì)量，左心室測(cè)壓完成后處死大鼠后分離出左心室，濾紙吸干水分后電子天平稱(chēng)重，計(jì)算大鼠LVMI=左心室質(zhì)量（mg）∕體質(zhì)量（g）。

1.8 心臟組織JAK1 及STAT3 蛋白表達(dá)的檢測(cè)取100 mg 心臟組織，加入少量液氮快速研磨后，加入蛋白裂解液，冰浴裂解20 min，14 000g，4 ℃離心20 min，取上清，BCA 法蛋白定量。制膠，上樣，電泳后冰上轉(zhuǎn)膜，洗膜后10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗（1∶1 000 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入ECL 發(fā)光底物，暗室壓片曝光。內(nèi)參蛋白為β-actin。Image-Pro Plus 6.0 軟件分析蛋白灰度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析研究數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠超聲心動(dòng)圖參數(shù) TAAC 術(shù)大鼠壓力超負(fù)荷造模成功，腹腔連續(xù)給藥8 周后，與TAAC組及vehicle組相比較，Calycosin組大鼠IVS、LVPW明顯減?。≒＜0.01），LVEDD 及LVESV 均明顯增大（P＜0.05），LVEDV 明顯增加（P＜0.01）；與TAAC組及vehicle組相比較，Calycosin組大鼠LVESD 有增大，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組大鼠LVEF 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 大鼠超聲心動(dòng)圖參數(shù)比較Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters in rats±s

表1 大鼠超聲心動(dòng)圖參數(shù)比較Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters in rats±s

組別TAAC組Vehicle組Calycosin組IVS（cm）0.195±0.013 0.189±0.011 0.158±0.009#LVEDD（cm）0.521±0.038 0.551±0.023 0.625±0.090*LVPW（cm）0.223±0.022 0.201±0.026 0.169±0.027#LVESD（cm）0.231±0.047 0.228±0.041 0.241±0.026 LVEDV（mL）0.371±0.063 0.383±0.057 0.581±0.027#LVESV（mL）0.047±0.031 0.053±0.028 0.081±0.018*LVEF（%）89.4±3.6 88.3±3.2 86.1±4.7

2.2 LVMI 的變化 與TAAC組及vehicle組比較，Calycosin組LVMI 顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠左心室有創(chuàng)壓比較 與TAAC組及vehicle組比較，Calycosin組大鼠左心室舒張末壓無(wú)明顯改變（P＞0.05），左心室收縮末壓明顯下降（P＜0.05），±dp∕dt max 值明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 各組大鼠心臟組織JAK1、STAT3 蛋白表達(dá)情況 腹腔給藥8 周后，處死大鼠，取出心臟組織，WB 檢測(cè)提示，與TAAC組及vehicle組比較，Calycosin組大鼠心肌組織JAK1 及STAT3 蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

表2 大鼠LVMI 的變化Tab.2 Changes of left ventricular mass index（LVMI）in rats ±s

表2 大鼠LVMI 的變化Tab.2 Changes of left ventricular mass index（LVMI）in rats ±s

注：*與TAAC組及vehicle組比較，Calycosin組LVMI 顯著降低（P＜0.05）

組別TAAC組Vehicle組Calycosin組LVMI（mg∕g）2.45±0.16 2.38±0.18 2.21±0.21*

表3 大鼠左心室有創(chuàng)壓比較Tab.3 Comparison of left ventricular invasive pressure in rats±s

表3 大鼠左心室有創(chuàng)壓比較Tab.3 Comparison of left ventricular invasive pressure in rats±s

注：與TAAC組及vehicle組比較，*P＜0.05

組別TAAC組Vehicle組Calycosin組LVEDP（mmHg）2.97±1.86 3.52±1.91 3.15±1.79 LVSP（mmHg）151.14±6.28 149.47±7.13 136.09±8.32#+dp∕dtmax（mmHg∕s）5912±378 5984±335 6375±385*-dp∕dtmax（mmHg∕s）5459±427 5527±409 5981±411*

3 討論

心肌肥厚是由心肌損害所引起的一系列慢性、進(jìn)行性病理生理變化，它主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的肥大、質(zhì)量∕容量比增加、室壁張力指數(shù)增加和間質(zhì)成分的改變，結(jié)果是心肌過(guò)度伸長(zhǎng)，心肌細(xì)胞壞死和左室擴(kuò)張、導(dǎo)致心室重構(gòu)。心肌肥厚常常發(fā)生在高血壓、缺血性心臟病和心力衰竭。它是心肌細(xì)胞對(duì)機(jī)械、神經(jīng)激素和炎癥因子刺激的主要反應(yīng)之一，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的體積增大、蛋白合成增加和橫紋肌結(jié)構(gòu)的改變，并沒(méi)有心肌細(xì)胞數(shù)量的增多。這種改變使心肌細(xì)胞收縮力增強(qiáng)，從而提高心輸出量。最初心肌的肥厚是為了保持最優(yōu)化的生物力學(xué)應(yīng)力和正常的心臟泵功能，但是這種不正常的增生最后使心臟功能失調(diào)。最初作為心肌適應(yīng)性反應(yīng)的心肌肥厚，最后常常導(dǎo)致心室重構(gòu)、心室擴(kuò)大和心力衰竭甚至死亡。心肌肥厚所致心室重構(gòu)已被證實(shí)是引起心血管疾病發(fā)生率和死亡率顯著升高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

圖1 大鼠心臟組織JAK1、STAT3 蛋白表達(dá)情況Fig.1 The expression of JAK1 and STAT3 in rat heart

黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘、性溫，有補(bǔ)氣升陽(yáng)，固表止汗，托毒排膿，利水消腫和生肌等功效。臨床研究發(fā)現(xiàn)黃芪對(duì)心肌缺血∕再灌注損傷及病毒感染的心肌均具有明顯的保護(hù)作用，以及能改善心功能，對(duì)心力衰竭有明顯的治療效果［8-9］。多年來(lái)對(duì)單味黃芪、復(fù)方及黃芪的有效成分進(jìn)行了大量的心血管藥理方面的研究及探討，發(fā)現(xiàn)黃芪提取物具有抑制心肌肥厚的作用，可能和其抑制炎癥因子防止脂質(zhì)過(guò)氧化，清除氧自由基，提高線粒體活性以及抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載等有關(guān)。有研究顯示黃芪能抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚，還能逆轉(zhuǎn)壓力超負(fù)荷大鼠和腎性高血壓大鼠的左室肥厚。對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠黃芪能改善心功能，減輕心肌組織水腫［8-11］。黃芪提取物還可明顯改善大鼠心肌梗死后異常的血液流變學(xué)指標(biāo)、組織病變及膠原纖維構(gòu)成比例［12］。黃芪提取物含有多種化學(xué)成分，包括有黃酮類(lèi)、皂甙類(lèi)、多糖類(lèi)、氨基酸以及微量元素，其成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)并不明確，難以標(biāo)準(zhǔn)化和國(guó)際化。

心肌肥厚病理生理過(guò)程中，主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、鈣調(diào)蛋白依賴的磷酸酶（calmodulin-dependent phosphatase）以及JAK∕STAT信號(hào)通路［13-15］。JAK∕STAT 信號(hào)通路在近年來(lái)備受重視。許多致心肌肥厚刺激信號(hào)均能激活心肌JA K∕STA T 信號(hào)通路，如：AngII、IL-6、TNF- α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、CT-1、壓力負(fù)荷等［16］。AK∕STAT信號(hào)通路在壓力負(fù)荷介導(dǎo)的心肌肥厚中的作用機(jī)制尚未完全闡明，可能與促進(jìn)ANP 基因表達(dá)、Ang II 自分泌增加相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，TAAC 心臟肥厚大鼠模型JAK∕STAT 信號(hào)通路激活，富氫鹽水抑制心肌肥厚的同時(shí)降低了JAK∕STAT 信號(hào)通路活性［17］。在本研究中，毛蕊異黃酮減輕TAAC 大鼠心臟肥厚的同時(shí)，心臟組織中JAK∕STAT 信號(hào)通路活性明顯下降。

綜上所述，毛蕊異黃酮作為黃芪的主要生物活性成分，也具有抑制壓力超負(fù)荷大鼠的心室重構(gòu)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)降低JAK∕STAT 信號(hào)通路活性，這一發(fā)現(xiàn)為改善慢性心力衰竭患者心室重構(gòu)提供了新的治療思路。