HBV-DNA實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)程序的測(cè)量不確定度評(píng)估及分析

劉偉平，楊新春，殷明剛

(自貢市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川自貢 643000)

測(cè)量不確定度是一個(gè)與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，其表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性[1-2]。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)15189：2012《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的專用要求》明確指出，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)為檢驗(yàn)過程中用于報(bào)告患者樣品被測(cè)量值的每個(gè)測(cè)量程序確定測(cè)量不確定度。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)規(guī)定每個(gè)測(cè)量程序的測(cè)量不確定度性能要求，并定期評(píng)審測(cè)量不確定度的評(píng)估結(jié)果[3]。因此，進(jìn)行測(cè)量不確定度評(píng)估對(duì)實(shí)驗(yàn)室具有重要意義。檢驗(yàn)項(xiàng)目的不確定評(píng)定可通過實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)計(jì)算出來[4-7]。本研究采用實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制的中間精密度和衛(wèi)生部室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果，計(jì)算了乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量項(xiàng)目的測(cè)量不確定度。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 StrataGene Mx3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Agilent公司，HBV-DNA熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自湖南圣湘生物科技有限公司，室內(nèi)質(zhì)控品為自制質(zhì)控品。

1.2方法

1.2.1檢測(cè)程序 每年定期對(duì)StrataGene Mx3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)，同時(shí)，每年對(duì)HBV-DNA熒光定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，每批次試劑均進(jìn)行留樣再測(cè)比對(duì)，確定檢測(cè)試劑盒的性能達(dá)到要求。自制HBV-DNA室內(nèi)質(zhì)控品，保存于-70 ℃超低溫冰箱，使用前進(jìn)行全面性能評(píng)價(jià)，穩(wěn)定性好。

1.2.2中間精密度測(cè)定 收集2016年10-12月獲得的相同批號(hào)室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果，計(jì)算批間變異系數(shù)(CV%)，其數(shù)值等于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)測(cè)量不確定度[urel(Rw)]。

2 結(jié) 果

2.1偏倚引入的測(cè)量不確定度評(píng)估結(jié)果 通過2014-2016年衛(wèi)生部室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果計(jì)算所得HBV-DNA偏倚引入的相對(duì)測(cè)量不確定度為5.27%。見表1。

2.2實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)量重復(fù)性引入的測(cè)量不確定度評(píng)估結(jié)果 質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)均值為4.03，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)測(cè)量不確定度(urel)為3.45%。見表2。

表1 偏倚引入的測(cè)量不確定度評(píng)估結(jié)果

表2 HBV-DNA的中間精密度測(cè)定結(jié)果(n=40)

2.3HBV-DNA的相對(duì)擴(kuò)展不確定度 由表1、表2計(jì)算得到相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度(ucref)為6.3%；相對(duì)擴(kuò)展不確定度為12.6%(K=2)。

3 討 論

醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可已成為我國(guó)三級(jí)甲等醫(yī)院檢驗(yàn)科提升檢驗(yàn)質(zhì)量和能力的重要途徑。ISO15189實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可明確要求實(shí)驗(yàn)室要評(píng)估定量項(xiàng)目的測(cè)量不確定度。測(cè)量不確定度與檢驗(yàn)總誤差概念和意義有一定區(qū)別[7]。

評(píng)定測(cè)量不確定度評(píng)定的意義主要體現(xiàn)在以下2個(gè)方面：(1)確認(rèn)患者結(jié)果是否符合實(shí)驗(yàn)室設(shè)定的質(zhì)量目標(biāo)，確定將患者結(jié)果與之前相同類型的結(jié)果或臨床決定值進(jìn)行比對(duì)時(shí)其變化或波動(dòng)值在多大范圍內(nèi)有意義。(2)實(shí)驗(yàn)室在解釋測(cè)量結(jié)果量值時(shí)應(yīng)考慮測(cè)量不確定度。通過對(duì)不確定度的評(píng)價(jià),可提高實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平，有助于臨床醫(yī)生更好地理解、使用檢驗(yàn)結(jié)果[8]。HBV-DNA定量已廣泛用于乙型肝炎患者臨床療效判斷和預(yù)后評(píng)估，測(cè)量不確定度結(jié)果可作為檢驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量的參考依據(jù)[9-10]。

測(cè)量不確定度可在中間精密度條件下通過測(cè)量質(zhì)控物獲得的量值進(jìn)行計(jì)算，這些條件包括測(cè)量程序標(biāo)準(zhǔn)操作中盡可能多而合理的常規(guī)變化。評(píng)定偏倚的測(cè)量不確定度主要通過測(cè)量有證參考物質(zhì)、利用室間質(zhì)評(píng)等獲得[11-12]。

本研究采用弱陽性水平HBV-DNA質(zhì)控品獲得的中間精密度和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果評(píng)定了HBV-DNA在該水平上的不確定度。實(shí)際測(cè)量過程相關(guān)聯(lián)的不確定度分量應(yīng)從接收樣品啟動(dòng)測(cè)量程序開始，至輸出測(cè)量結(jié)果終止。按本方法計(jì)算所得測(cè)量不確定度不確定來源上主要包含了分析測(cè)量階段中各種影響組分(如操作人員、儀器、試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、環(huán)境條件等)的變異。但未包括與分析前和分析后階段相關(guān)的測(cè)量不確定度分量，也未包括由于人群生物學(xué)變異而產(chǎn)生的測(cè)量不確定度。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的目標(biāo)不確定度，以評(píng)價(jià)各檢驗(yàn)指標(biāo)是否滿足臨床要求[13-14]。目前，尚未有檢驗(yàn)程序的測(cè)量不確定度的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或性能規(guī)范，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，擴(kuò)展不確定度若大于10%，需改善檢測(cè)系統(tǒng)性能及穩(wěn)定性，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度[15]。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身的條件，制定HBV-DNA的目標(biāo)不確定度為10%。而本研究評(píng)定得到的相對(duì)不確定度(12.6%)略高于實(shí)驗(yàn)室設(shè)定的目標(biāo)不確定度，提示應(yīng)從檢測(cè)人員、檢測(cè)儀器、檢測(cè)試劑和方法、所使用的校準(zhǔn)品和質(zhì)控品、環(huán)境溫濕度條件等方面入手，采取加強(qiáng)人員培訓(xùn)、提高試劑質(zhì)量、變更方法、加強(qiáng)儀器檢定和校準(zhǔn)、嚴(yán)格控制環(huán)境溫濕度，逐步改進(jìn)檢驗(yàn)質(zhì)量，以縮小測(cè)量不確定度，為臨床疾病的診治提供更有價(jià)值的參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

HBV-DNA實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)程序的測(cè)量不確定度評(píng)定具有重要意義，可作為臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量持續(xù)改進(jìn)的依據(jù)，并用于解釋臨床檢驗(yàn)結(jié)果。