保婦康栓對宮頸癌細(xì)胞SiHa體外增殖和凋亡的影響

李倩珺，胡藝琳，梁 琰，王 婷，吳曉賓，晁 艷△

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州 510120；2.深圳市婦幼保健院，廣東深圳 518028；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東廣州 510120。)

宮頸癌是女性生殖器官腫瘤中最常見的腫瘤之一，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是目前認(rèn)為導(dǎo)致宮頸癌最主要的因素[1-2]。當(dāng)今宮頸癌的治療手段包括手術(shù)，放、化療等，但這些措施均存在一定的弊端，如出現(xiàn)機體免疫功能下降，反生并發(fā)癥，甚至死亡等[3]。近年來，中醫(yī)藥在抗病毒及抗腫瘤方面的作用日益引起關(guān)注，但其發(fā)揮作用的機制尚不明了[4-5]。純中藥栓劑保婦康栓由莪術(shù)油和冰片2味中藥組成，可活血化瘀、清熱解毒、去腐生肌，常用于治療宮頸HPV感染。保婦康栓可改善局部免疫微環(huán)境并消除HPV感染，降低了高危型HPV感染患者向?qū)m頸進展的危險性[6-7]。因此，本研究通過制備保婦康栓含藥血清并作用于HPV16陽性人宮頸鱗癌細(xì)胞系SiHa細(xì)胞，觀察細(xì)胞體外增殖及凋亡情況，旨在為臨床應(yīng)用中藥預(yù)防并治療HPV感染提供重要的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，二甲基亞砜購自上海華舜產(chǎn)品，青霉素和鏈霉素購自華北制藥廠，胰酶及乙二胺四乙酸購自SERVA公司及賽多利斯公司，CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，核糖核酸酶和聚酰亞胺購自Sigma公司。

1.2藥物 保婦康栓主要成分為莪術(shù)油及冰片制成的溶液購自海南碧凱藥業(yè)有限公司。重組人干擾素α-2b 水針劑購自安徽安科生物工程股份有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 選用細(xì)胞系為HPV16陽性人宮頸鱗癌細(xì)胞系SiHa，培養(yǎng)條件為于胎牛血清10%、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL，DMEM培養(yǎng)基，5%CO2、溫度37 ℃及飽和濕度。

1.3.2含藥血清的提取 選取雌性SD大鼠60只,平均體質(zhì)量(200±30)g，隨機分為中藥組(保婦康栓組)、陽性對照組(干擾素組)和陰性對照組。每組每天灌胃給藥1次，連續(xù)7 d，陽性對照組肌肉注射給藥5 d。給藥劑量為人臨床給藥等效劑量的10倍(200 g體質(zhì)量大鼠給藥劑量=60 kg體質(zhì)量人給藥劑量×0.018×100)。中藥在末次給藥后1 h，西藥在肌肉注射后40 min，腹主動脈采血，血樣于37 ℃水浴30 min，3 000 r/min離心10 min，吸取血清后滅活(56 ℃水浴30 min)并除菌(0.22 μm微孔濾膜過濾)，分裝于1 mL無菌EP管備用。

1.3.3CCK-8比色法觀察藥物對SiHa細(xì)胞的生長抑制作用 取數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化離心后進行細(xì)胞計數(shù)(1 × 104個/mL)，接種于96孔培養(yǎng)板 (每孔100 μL)，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后加入8%含藥血清培養(yǎng)基(設(shè)6個平等對照孔)，使終體積為200 μL，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48、72 h后加入20 μL CCK-8試劑，混勻，酶標(biāo)儀測定每孔吸光度(OD值)。

1.3.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡 每孔2 mL細(xì)胞懸液(2×105個/孔)加入6孔板中；置37 ℃培養(yǎng)箱24 h后加入8%含藥血清培養(yǎng)基(100 μL/孔)，同時設(shè)陰性對照組；培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)72 h，消化并收集細(xì)胞。固定(-20 ℃無水乙醇)制備好的單細(xì)胞懸液，加入100 μL RNaseA，37 ℃ 30 min；再加入400 μL碘化丙啶PI染色30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測。每個樣本獲取10 000個細(xì)胞，采用ModFitLT 3.0軟件分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1CCK8檢測細(xì)胞增殖 中藥物組和陽性對照組SiHa細(xì)胞增殖均有不同程度的抑制，陰性對照組細(xì)胞生長活躍，中藥物組和陽性對照組與陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且在24 h對其增殖的影響最為明顯。見表1。

表1 各組宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖比較值)

注:與陰性對照組比較，*P<0.05

2.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化 與陰性對照組比較，中藥物組和陽性對照組SiHa細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞顯著增多，S期細(xì)胞顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組SiHa細(xì)胞周期比較(%)

注:與陰性對照組比較，*P<0.05

2.3流式細(xì)胞儀檢測凋亡變化 中藥物組和陽性對照組SiHa細(xì)胞凋亡率顯著高于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組SiHa細(xì)胞凋亡率比較

注:與陰性對照組比較，*P<0.05

3 討 論

宮頸癌是女性發(fā)生比例較高的惡性腫瘤之一，其在發(fā)展中國家的發(fā)病率較高。宮頸癌發(fā)生過程通常為正常宮頸上皮發(fā)展為上皮內(nèi)瘤變最后進展為宮頸癌，其中高危型HPV持續(xù)感染是促進瘤變發(fā)生的主要因素。

保婦康栓的主要成分為冰片和莪術(shù)。莪術(shù)為姜科姜黃屬植物蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)和溫郁金的干燥根莖，性溫味辛苦，具有較好的抗腫瘤、抗炎、抗病原體、抗早孕、抗纖維組織增生和保肝等多種作用。其活性成分為揮發(fā)油，包括β-欖香烯、莪術(shù)酮、莪術(shù)醇和吉瑪酮等，能直接抑制、破壞腫瘤細(xì)胞和滅活病原體，還可增強機體自身免疫功能，從而促進機體對腫瘤和病毒的免疫反應(yīng)[8-13]。冰片亦可消炎止痛并促進藥物吸收。保婦康栓單獨或聯(lián)合用藥已成為宮頸持續(xù)性高危型HPV感染的主要治療手段之一，將保婦康栓置于患者宮頸內(nèi)部，莪術(shù)油可活血化瘀、清熱解毒，提升局部免疫力，增加巨噬細(xì)胞吞噬能力，去腐生肌，消滅HPV及多種致病菌，促進鱗狀上皮細(xì)胞生長，修復(fù)炎癥損傷，促進康復(fù)[6-7]。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞增殖和凋亡異常密切相關(guān)，因此，臨床治療腫瘤重要的策略之一就是誘導(dǎo)、促進腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，本研究選擇HPV16陽性人宮頸鱗癌細(xì)胞系SiHa細(xì)胞作為研究對象，通過CCK8實驗發(fā)現(xiàn)，保婦康栓含藥血清能抑制SiHa細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，保婦康栓含藥血清作用后可引起SiHa細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞顯著增多，S期細(xì)胞顯著減少，周期阻斷于S期，即細(xì)胞的DNA合成期，以致細(xì)胞不能進入下一個周期，細(xì)胞增殖減少，凋亡增加。以往有研究表明，莪術(shù)油的主要成分姜黃素和欖香烯對腫瘤細(xì)胞周期具有抑制作用[10,14-15]。說明保婦康栓含藥血清能抑制SiHa細(xì)胞增殖的作用機制可能是由于藥物誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡程序。

4 結(jié) 論

中藥保婦康栓對宮頸癌的預(yù)防和治療作用機制可能是通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的。然而中藥保婦康栓體外抑制SiHa細(xì)胞增殖的效果弱于西藥干擾素，這也是臨床單獨應(yīng)用保婦康栓可使癥狀緩解但無法徹底治愈的原因之一，因此，臨床常采用聯(lián)合用藥，效果更顯著。