難治性慢性丙型肝炎中醫(yī)證型與HLA-DP基因SNP的相關(guān)性研究

韓豎霞，鄭 毅，彭曉明，趙友云△

(1.湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)藥研究院，湖北武漢 430074)

ThecorrelationanalysisbetweensyndrometypesoftraditionalChinesemedicineandHLA-DPgenepolymorphismsinpatientswithrefractorychronichepatitisC*

HANShuxia1,2,ZHENGYi1,2,PENGXiaoming1,2,ZHAOYouyun1,2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,HubeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Wuhan,Hubei430061,China;2.HubeiProvinceAcademyofTraditionalChineseMedicine,Wuhan,Hubei430074,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the correlation between syndrome types of traditional Chinese medicine (TCM) and HLA-DP gene polymorphisms in patients with refractory chronic hepatitis C (RCHC),and to find suitable molecular markers for TCM syndromes and provide scientific basis for TCM syndrome differentiation.MethodsA total of 200 RCHC patients of Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine were enrolled retrospectively.Their general characteristics,TCM syndromes,data of liver function (ALT，AST，ALP and ALB),HCV RNA,HCV genotypes,PT and PLT were collected.At the same time,100 patients from other departments of the hospital were enrolled as control group.FQ-PCR was used to detect the genotypes of the HLA-DP gene rs9277535 sites of the RCHC patients with different TCM syndromes and the patients of control group.The correlation between the data and TCM syndromes was statistically analyzed.ResultsAmong 200 patients in the study,the pattern of liver-depression and spleen-deficiency was maximum (100 cases,50.0%),while the remaining syndromes were dampness and heat resistance (48 cases,24.0%),yin deficiency of liver and kidney (32 cases,16.0%) and obstruction of collaterals by blood stasis (20 cases,10.0%).For age,data of liver function index and HCV RNA,there was no statistical difference between the liver-depression and spleen-deficiency type and other TCM syndromes (P>0.05).But the difference of PT was significant between liver-depression and spleen-deficiency type and other TCM syndromes (P<0.05).Compared with control group,there was no significant difference between the HLA-DP gene rs9277535 genotype GG and AA in the liver depression spleen deficiency group and the non-liver depression spleen deficiency group in the RCHC patients (P>0.05).ConclusionThere was no significant difference between the genotypes of HLA-DP gene rs9277535 genotype GA heterozygous genes and AA homozygous genes in the different TCM syndromes of RCHC patients.However,the distribution of alleles G and A in liver depression spleen deficiency group and non-liver depression spleen deficiency group showed a different trend,which is worthy of further study.

Keywords:refractory chronic hepatitis C; traditional Chinese medicine； syndrome; HLA-DP; polymorphisms； HCV

丙型肝炎是嗜肝病毒中丙型肝炎病毒(HCV)引起的一種肝炎，感染后可以導(dǎo)致肝臟炎癥性壞死甚至導(dǎo)致肝硬化和肝癌,由于其進(jìn)展隱匿、慢性率高及預(yù)后不良而備受關(guān)注[1]。以干擾素為基礎(chǔ)的治療方案在臨床上一度居于主導(dǎo)地位，但由于療程長、有效率低、不良反應(yīng)大等許多問題仍未得到根本解決，使得在治療過程中，存在治療無應(yīng)答者、不耐受者、停藥后復(fù)發(fā)者等，即難治性慢性丙型肝炎(RCHC)的產(chǎn)生[2]。

中醫(yī)以其整體觀和辨證論治的特點(diǎn)，在治療RCHC上有一定的優(yōu)勢，可以通過分析不同患者的中醫(yī)證型來進(jìn)行個(gè)體化用藥。然而，由于目前缺乏統(tǒng)一明確的丙型肝炎辨證分型標(biāo)準(zhǔn)，臨床分型存在一定程度的主觀性和隨意性[3]。因此，需要尋找一種可重復(fù)、準(zhǔn)確可靠的分子標(biāo)志物以揭示中醫(yī)證型的內(nèi)涵，以此更好地指導(dǎo)臨床醫(yī)生個(gè)體化用藥。白細(xì)胞抗原(HLA)DP基因編碼HLA-DP抗原，此抗原的多少直接影響抗原遞呈與免疫應(yīng)答的過程。因此，本研究旨在探索人類HLA-DP基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)常見位點(diǎn)的基因型與RCHC中醫(yī)證型是否存在相關(guān)性，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 200例RCHC患者均為2015年1月至2016年12月在湖北省中醫(yī)院住院的患者，按中醫(yī)證型分為肝郁脾虛組和非肝郁脾虛組(含肝腎陰虛型、濕熱內(nèi)阻型、淤血阻絡(luò)型)。其中肝郁脾虛組男55例，女45例，年齡20～80歲，平均54.45歲；非肝郁脾虛組男53例，女47例，年齡26～80歲，平均59.05歲。100例對照人群為湖北省中醫(yī)院骨科、肛腸科、耳鼻喉科住院患者，性別和年齡與RCHC患者差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) RCHC的診斷均參考《丙型肝炎防治指南(2015更新版)》[4]； 肝郁脾虛型、肝腎陰虛型、濕熱內(nèi)阻型、淤血阻絡(luò)型的中醫(yī)證型分型參考2017年中華中醫(yī)藥學(xué)會肝膽病專業(yè)委員會制訂的《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)(2017年版)》[5]，以上判定均由兩位主治醫(yī)師共同判斷，并由一位主任醫(yī)師審核確定。

1.3納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述RCHC診斷標(biāo)準(zhǔn)且符合中醫(yī)證型者，均簽有知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并HIV和(或)其他嗜肝病毒感染的肝炎；伴有心、腎、肺、內(nèi)分泌、血液、代謝及胃腸道嚴(yán)重原發(fā)??；不能合作者或精神病患者；哺乳、妊娠或正準(zhǔn)備妊娠的婦女，以及過敏體質(zhì)者。

1.4檢測指標(biāo)

1.4.1常規(guī)指標(biāo) 肝功能相關(guān)指標(biāo)[丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、清蛋白(ALB)]由RoCH moduleP800全自動生化分析儀完成；HCV RNA檢測采用美國ABI Dx全自動熒光定量PCR儀完成；血小板計(jì)數(shù)(PLT)由貝克曼DxH 800完成；凝血酶原時(shí)間(PT)檢測采用沃芬ACLTOP700完成。

1.4.2基因組DNA的提取及HLA-DP基因分型 按湖北省中醫(yī)院用戶手冊標(biāo)準(zhǔn)采集所有研究對象外周靜脈EDTA抗凝血液5 mL；依照基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司生產(chǎn))操作說明書的步驟提取人類基因組DNA；再采用超微量核酸分析儀(Eppendorf公司，德國)測定DNA濃度；根據(jù)HCV基因組5′-UTR、C/E1和NS5B的序列及HLA-DP基因rs9277535位點(diǎn)G/A，采用Vector NTI11.0軟件設(shè)計(jì)引物和探針序列，送上海生工生物工程有限公司合成引物和探針序列，見表1。采用優(yōu)化后的雙重FQ-PCR技術(shù)同步檢測標(biāo)本中HLA-DP基因rs9277535位點(diǎn)G或A。優(yōu)化后的雙重?zé)晒舛烤酆厦告湻磻?yīng)(FQ-PCR)反應(yīng)體系：2xTaqMan Fast qPCR Master Mix 5.00 μL，10 μmol/L正向引物0.25 μL，10 μmol/L反向引物0.25 μL，10 μmol/L A-、G-探針各0.20 μL，DNA模板0.20 μL，ddH2O 2.10 μL。

2 結(jié) 果

2.1RCHC中醫(yī)證型的分布 200例RCHC中醫(yī)證型中，肝郁脾虛證最多(100例)，占50.0%；其次分別是濕熱內(nèi)阻證(48例)，占24.0%；肝腎陰虛證(32例)，占16.0%；淤血阻絡(luò)證(20例)，占10.0%。

2.2RCHC肝郁脾虛證和非肝郁脾虛證的基本信息和常規(guī)指標(biāo) RCHC肝郁脾虛證與非肝郁脾虛證相比，肝功能指標(biāo)、HCV RNA含量及其基因型差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；其中RCHC患者不同證型的HCV基因型均以1b型為主，凝血系統(tǒng)中PT指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 HLA-DP基因rs9277535位點(diǎn)的FQ-PCR引物及探針序列

2.3RCHC不同證型患者HLA-DP基因rs9277535多態(tài)性 HLA-DP基因rs9277535位點(diǎn)中，與野生純合型GG相比，GA雜合型和AA突變基因型在對照組、肝郁脾虛組和非肝郁脾虛組3組中的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；等位基因G、A的分布在3組中差異也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表2 不同中醫(yī)證型RCHC患者基本信息和常規(guī)指標(biāo)比較

注：*表示肝腎陰虛型或濕熱內(nèi)阻型或淤血阻絡(luò)型中任一證型均歸為非肝郁脾虛組

表3 RCHC不同證型患者HLA-DP rs9277535多態(tài)性的分布情況[n(%)]

注：*為非肝郁脾虛組指肝腎陰虛型或濕熱內(nèi)阻型或淤血阻絡(luò)型；#為對照組與肝郁脾虛組比較；△為對照組與非肝郁脾虛組比較；▲為肝郁脾虛組與非肝郁脾虛組比較

3 討 論

近年來，人們對于慢性丙型肝炎的認(rèn)識不斷深入，國家衛(wèi)生健康委員會疾病預(yù)防控制局官網(wǎng)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，每年該病的發(fā)病率和病死率也呈上升趨勢。雖然中醫(yī)、西醫(yī)對慢性丙型肝炎的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，治療方面也取得了很大的突破，已有聚乙二醇干擾素(Peg-IFN)聯(lián)合利巴韋林(RBV)的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案和DAA治療方案，特別是DAA的上市是丙型肝炎治療的一次飛躍，使其治愈率大大提高[6]。但由于我國丙型肝炎患者的高SVR率、居民經(jīng)濟(jì)承受能力、衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)因素、DAA高昂的價(jià)格、未知的遠(yuǎn)期耐藥、復(fù)發(fā)和藥物間相互作用等諸多原因，使得Peg-IFN聯(lián)合RBV治療仍然是我國現(xiàn)階段丙型肝炎抗病毒治療的主要方案[7]。在治療過程中存在治療無應(yīng)答者、不耐受者、停藥后復(fù)發(fā)者；HCV的基因型為1型者；伴有肝炎肝硬化、非酒精性脂肪肝、代謝綜合征、胰島素抵抗者；HBV/HCV、HIV/HCV重疊感染者；器官移植患者等，均導(dǎo)致了RCHC的產(chǎn)生[8-10]。因此，RCHC已成為目前困擾肝病領(lǐng)域的重要科學(xué)問題。

HLA-DP分子主要分布于抗原遞呈細(xì)胞(APC)，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、胸腺上皮細(xì)胞和活化的T細(xì)胞等的表面。HLA-DP基因?qū)儆贖LA-Ⅱ類基因，位于染色體6p21.23，其基因多態(tài)性與機(jī)體免疫應(yīng)答相關(guān)，在肝硬化基因研究中，HLA基因逐漸受到關(guān)注。有學(xué)者通過Meta分析發(fā)現(xiàn)HLA-DP基因rs9277535位點(diǎn)A等位基因?yàn)镠BV感染的保護(hù)因素，可顯著增加HBV自發(fā)清除[11]。HUANG等[12]研究證實(shí)，HLA-DP rs9277535基因突變型與HCV持續(xù)感染和丙型肝炎慢性化進(jìn)展速度相關(guān)，同時(shí)該基因還與肺癌、卵巢癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，兒童HBV易感性，系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性等密切相關(guān)。

中醫(yī)證型是RCHC辨證施治的關(guān)鍵。HLA-DP基因多態(tài)性與HCV持續(xù)感染密切相關(guān)，其個(gè)體化理念與中醫(yī)辨證施治高度相似，課題組提出HLA-DP基因多態(tài)性與RCHC中醫(yī)證型相關(guān)性的科學(xué)假說，尋找中醫(yī)證型的分子標(biāo)志物，為中醫(yī)辨證提供科學(xué)依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，RCHC肝郁脾虛證與非肝郁脾虛證相比，肝功能、HCV-RNA水平及其基因型差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但HCV基因型均以1b型為主；同時(shí)年長的RCHC患者更易出現(xiàn)非肝郁脾虛證，即肝腎陰虛型或濕熱內(nèi)阻型或淤血阻絡(luò)型；凝血系統(tǒng)中PT指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

研究發(fā)現(xiàn)，HLA-DP基因rs9277535位點(diǎn)中，與野生純合型GG相比，GA雜合型和AA突變基因型在對照組、肝郁脾虛組和非肝郁脾虛組3組間均無顯著性差異；但等位基因G和A的分布在肝郁脾虛組和非肝郁脾虛組2組間有差異趨勢，可作為中醫(yī)證型分型的潛在標(biāo)志物，對于傳統(tǒng)中醫(yī)理論研究具有一定的創(chuàng)新價(jià)值，可進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本課題組在RCHC中醫(yī)證型分子分型研究中，發(fā)現(xiàn)肝郁脾虛證最多，肝臟功能損傷程度及病毒水平在不同證型之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HLA-DP基因rs9277535位點(diǎn)中等位基因G和A的分布在不同證型間有一定的差異趨勢，因此，推斷rs9277535位點(diǎn)中等位基因G和A可能是RCHC不同中醫(yī)證型的潛在標(biāo)志物，值得關(guān)注。本研究雖然得出了可能與RCHC中醫(yī)證型密切相關(guān)的HLA-DP等位基因，但仍然難以明確定論。同時(shí)，由于本研究病例僅來自湖北省中醫(yī)院，各種證型的病例數(shù)偏少，不夠全面。因此，為更準(zhǔn)確地反映HLA-DP基因SNP與RCHC中醫(yī)證型的相關(guān)性，尚有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，開展多地域、多民族的深入研究，以探索中醫(yī)證型的分子機(jī)制。