區(qū)分牛羊布病免疫抗體與感染抗體的技術(shù)應(yīng)用

任宇斕，于厚軍

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第三師畜牧獸醫(yī)站，新疆 圖木舒克 844000）

布病是由布氏桿菌引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的一種人畜共患傳染病，人感染布氏桿菌后，需要長時間的抗生素治療，而且往往會留下嚴重的后遺癥。屬于我國規(guī)定的二類動物疫病，該病直接影響牛羊生產(chǎn)效益，并危害人類健康，《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012-2020）》將其列為二類動物疫病優(yōu)先防治病種之首，因此消除布病一直是公共健康計劃中最重要的目標之一。

2008年以前，我?guī)熣J真貫徹“以免疫為主的綜合防治”方針，堅持結(jié)合檢疫隔離、淘汰、撲殺等措施，對布病的防控起到一定的作用，直至2012年，全師布病陽性檢出率在0.03%以下。但近幾年，據(jù)師布病監(jiān)測報表顯示顯示布病陽性數(shù)不是梯次減少，而是出現(xiàn)反彈現(xiàn)象。布病防控又被提上議程。

根據(jù)國家及兵團《中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012-2020）》目標及要求，按照兵團及師制定的《畜間布病防控實施方案》，全師于2016～2018年開展牛、羊布病全面免疫。但是存在的問題是如何區(qū)分牛、羊布氏菌自然感染抗體和菌苗免疫抗體，成為布病防控的難題之一。因為布氏菌苗免疫以后所產(chǎn)生的各種血清學(xué)反應(yīng)和自然感染所產(chǎn)生的血清學(xué)反應(yīng)極其相似，若不加以甄別，可能導(dǎo)致感染陽性畜魚目混珠，針對這一問題，筆者于2016年度對我?guī)熍！⒀虿疾】贵w進行了長期監(jiān)測與分析，并采用多種檢測方法對比和重復(fù)對免疫抗體和感染抗體進行甄別和鑒定。為三師布病防控與凈化做好前期工作，為主管部門提供決策依據(jù)，同時，為維護動物食品安全和公共衛(wèi)生安全提供保障。

家畜布病的檢查主要有兩個方面，細菌學(xué)檢查和血清學(xué)檢查，前者是最可靠的手段，但因耗時長，常受技術(shù)、設(shè)備等限制，難以常規(guī)實施；血清學(xué)診斷也是檢查布病的主要方法，目前我國布病的血清學(xué)診斷主要使用虎紅平板凝集試驗，試管凝集試驗和補體結(jié)合試驗等。

1 免疫前檢疫工作

發(fā)動全師各農(nóng)牧團場獸醫(yī)骨干隊伍，對全師牛、羊采樣，利用常規(guī)平板凝集試驗進行全群檢疫，此項工作由于工作量大，對工作環(huán)境及人員防護具有一定的要求，因此執(zhí)行過程中先由各團場獸醫(yī)進行了全群采樣和虎紅平板凝集試驗初篩，對初篩陽性樣品，送師站由課題組成員復(fù)檢，對復(fù)檢陽性反應(yīng)的，及時反饋養(yǎng)殖場戶并對陽性樣品對應(yīng)畜進行強制隔離撲殺。如果此項檢疫工作不扎實，不徹底將會增加免疫抗體與感染抗體的甄別困難。免疫前檢疫陽性結(jié)果（見表1）。

此次檢疫共檢樣品360666份，其中牛10558份，無陽性樣品，羊350108份，虎紅平板凝集試驗初篩陽性數(shù)1620份，陽性率為0.46%；試管凝集實驗復(fù)檢陽性數(shù)1110份，陽性率為0.32%。熱敏感試驗驗證免疫抗體陽性樣品數(shù)為1110份，排除了免疫陽性的可能。補體結(jié)合試驗驗證感染抗體陽性樣品1110份，與試管凝集試驗復(fù)檢陽性數(shù)吻合。最終確定1110份陽性樣品均屬感染陽性，隔離撲殺羊只1110只。

2 全面免疫

依據(jù)兵團第三師畜間布病防控實施方案，嚴格按照疫苗使用說明書進行操作，全師使用疫苗為羊型M5號弱毒活菌苗。該菌苗毒力比較強，很穩(wěn)定，對牛、羊布魯菌均具有免疫力和保護力，此菌株作為疫苗尚有一定的毒性，而且在一定的條件下毒力可恢復(fù)，因此在免疫接種期間要嚴格做好個人防護和操作后消毒工作。免疫接種由各單位基層獸醫(yī)具體實施，課題組成員負責(zé)做好防護培訓(xùn)及技術(shù)指導(dǎo)。免疫前師站組織召開了布病免疫培訓(xùn)班，為全面免疫工作提供技術(shù)和保障。

3 免疫抗體與感染抗體鑒別技術(shù)

3.1 原理

根據(jù)免疫學(xué)理論無論是布氏桿菌自然感染或是人工免疫，經(jīng)過一定時間機體產(chǎn)生各種類型的抗體或不同類別的特異性免疫球蛋白，動物血清中首先開始形成的是IgM抗體，以后IgG抗體逐漸增加，并達到很高的水平能夠保持整個感染過程，在感染動物體中主要存在的是IgG抗體，含量高，持續(xù)時間長，也有一定量的IgM出現(xiàn)；而免疫機體中主要出現(xiàn)IgM抗體，而IgG抗體滴度低。而免疫動物體主要存在的是IgM類抗體。鑒于自然感染和菌苗免疫后產(chǎn)生的特異性抗體IgG、IgM具有量的差別而且還有時相的差異。

研究表明人及動物接種布病疫苗后，大約5d產(chǎn)生 IgM抗體，2周后可達高峰；而IgG抗體在4周左右達高峰，以后逐漸下降；而人及動物感染后數(shù)日出現(xiàn)IgM和IgG杭體，且IgM抗體很快下降，lgG抗體的高峰期可維持720d，1年后仍可維持在診斷水平，因此血清抗體IgG的存在乃是慢性布病感染過程的重要指征。特異性杭體IgG的測定具有重要臨床診斷意義，也是區(qū)別免疫接種和自然感染抗體的重要指標。由于CFT（補體結(jié)合試驗）所查的主要是lgG類抗體，因此CFT常用于布病疫苗免疫和自然感染抗體的鑒別診斷。

另外，IgM對熱是不穩(wěn)定的，加熱56℃就發(fā)生變性。隨溫度的升高變性加劇。65℃15min幾乎所有IgM都被破壞，故提高反應(yīng)溫度可抑制大分子抗體的凝集作用。試驗時，被檢血清按常規(guī)試管凝集法稀釋，先在62℃～64℃水浴中滅活30min，然后按常規(guī)加入抗原，放在溫箱中培養(yǎng)和觀察結(jié)果，自然感染的血清呈陽性反映，而人工免疫的血樣則基本上呈陰，這也是區(qū)別免疫抗體和自然感染抗體的重要指標。

3.2 定點采樣抽檢監(jiān)測及結(jié)果

選擇免疫接種15～35d的牛、羊養(yǎng)殖點，按比例采樣抽檢血液樣品共計3000份次，其中牛血樣500份，羊血樣2500份。所采樣品先用虎紅平板凝集試驗進行陽性初篩，再同步進行試管凝集和熱變性試驗，因為熱變性試驗的基礎(chǔ)試驗為試管凝集，只是試驗溫度不同。熱變性試驗也是免疫陽性抗體的驗證試驗。為確保試驗結(jié)果的準確率，檢測還同步進行了感染陽性的驗證即補體結(jié)合試驗。

虎紅平板凝集試驗初篩檢測牛477份陽性，陽性率95.4%，羊2417份陽性，陽性率96.7%，試管凝集試驗復(fù)檢牛樣品477份均為陽性，羊樣品2417份均為陽性。熱變性試驗檢測牛樣品477份均為陰性，羊樣品2417份均為陰性，據(jù)此初步說明試管凝集試驗復(fù)檢的陽性樣品均為免疫陽性樣品。補體結(jié)合試驗檢測樣品牛500份，羊2500份陽性數(shù)為零，據(jù)此說明所采牛、羊共計3000份樣品無布病感染陽性。同時進一步驗證了試管凝集試驗復(fù)檢的陽性樣品均為免疫陽性。免疫抗體和感染抗體鑒別結(jié)果（見表2）。

表1 免疫前檢疫陽性結(jié)果

表2 免疫抗體和感染抗體鑒別結(jié)果

4 分析與討論

4.1 免疫前檢疫工作需扎實徹底，否則會增加免疫抗體與感染抗體的甄別困難，檢疫中進行布病抗體鑒別的意義在于避免誤殺免疫外購畜。

4.2 有學(xué)者應(yīng)用利凡諾爾凝集試驗與補體結(jié)合試驗進行了符合率的驗證，結(jié)果表明補體結(jié)合試驗與利凡諾爾試驗的符合率為85.95%～98.14%，進一步驗證了補體結(jié)合試驗在免疫動物和感染動物的鑒別上的應(yīng)用價值。本項目未使用利凡諾爾試驗的原因是，該試驗對實驗室生物安全水平有一定的要求，師站生物安全資質(zhì)有限。

4.3 在免疫抗體和感染抗體鑒別檢測結(jié)果中未檢出感染抗體的原因分析，（1）所選采樣點免疫前檢疫、隔離、撲殺工作做得比較扎實徹底沒有遺漏感染陽性畜；（2）據(jù)調(diào)查在抽樣檢測期間，各采樣點沒有引進外購畜。