近紅外熒光傳感法測(cè)定中藥材中赭曲霉毒素A

曾云龍， 趙 敏， 張 敏， 易守軍， 唐春然， 夏曉東, 賀超才

(1. 湖南科技大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 理論有機(jī)和功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 湘潭 411201;2. 長(zhǎng)沙職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410217)

1 引 言

植物的植株、種子和莖塊通常是中藥材的主要組成部分，是中醫(yī)治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)。然而植物中藥材在生長(zhǎng)、收獲、運(yùn)輸、貯存等環(huán)節(jié)中極易受到霉菌污染[1-2]，藥材受到赭曲霉、純綠青霉和碳黑曲霉污染后，它們的代謝產(chǎn)物中存在高毒性赭曲霉毒素A(OTA)，致使中藥材中OTA污染普遍存在[3-7]。OTA具有致癌、致畸、致突變、腎毒性等毒性[8-9]。服用含有微量OTA的中藥，一般不會(huì)致病患者出現(xiàn)急性中毒現(xiàn)象，但它能在人體內(nèi)積蓄，對(duì)人造成慢性毒害，引發(fā)各種疾病。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)中藥對(duì)一些重大疾病和慢性病的療效較西藥更為顯著，且毒副作用較西藥低，因此，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家開始研究和使用中藥。但中藥(材)普遍受到真菌毒素污染，由此引發(fā)的安全性已受到國(guó)內(nèi)外的高度重視，歐盟規(guī)定辣椒、肉豆蔻、干姜、姜黃及其混合物中OTA的限量為15 μg·kg-1，甘草根的浸漬物中OTA 限量為20 μg·kg-1。我國(guó)是中草藥的發(fā)源地，目前大約有12 000種藥用植物，為了確保藥用安全并加速中藥國(guó)際化和現(xiàn)代化，對(duì)中藥材中OTA進(jìn)行監(jiān)測(cè)具有重要意義。

目前，中藥材中痕量OTA檢測(cè)方法主要有色譜法和酶聯(lián)免疫法[10-12]等。酶聯(lián)免疫法存在抗原/抗體和酶的價(jià)格高、且易失活而失效的問(wèn)題；色譜法及色-質(zhì)聯(lián)用法技術(shù)要求高、所需試劑純度高、儀器設(shè)備昂貴、分析成本高，不易普及。因此，非常有必要發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確的中藥材真菌毒素檢測(cè)方法。碳量子點(diǎn)碳源豐富，制備方法簡(jiǎn)單、環(huán)保，具有很好的光學(xué)特性和生物相容性，廣泛應(yīng)用于活體成像、醫(yī)療診斷和化學(xué)生物傳感等領(lǐng)域[13-15]。通常碳量子點(diǎn)熒光發(fā)射在400～550 nm可見(jiàn)光范圍，以其作為探針，易受內(nèi)源性物質(zhì)熒光的干擾，如果以近紅外熒光量子點(diǎn)為探針則能有效地消除內(nèi)源性物質(zhì)熒光的干擾。核酸適體具有選擇性高、穩(wěn)定性好、價(jià)格低等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、疾病診斷和食品安全監(jiān)測(cè)分析[16-18]；然而，核酸適體用于檢測(cè)中藥材中痕量OTA的報(bào)道較少。本文利用核酸適體高選擇性、近紅外熒光碳量子點(diǎn)優(yōu)異的熒光特性，建立了簡(jiǎn)單、快速、靈敏的中藥材中痕量OTA的生物傳感檢測(cè)新方法。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 主要試劑與儀器

巰基修飾的OTA核酸適體核酸(Apt)序列[16,19]:HS-AAAAAAGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、伏馬毒素B1(FB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等真菌毒素均由北京華安麥科生物技術(shù)有限公司提供；氯金酸、檸檬酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP) 等購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；考馬斯亮藍(lán)、葡萄糖和乙二胺等購(gòu)自國(guó)藥試劑有限公司；其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

熒光測(cè)定在RF-5301PC熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)上進(jìn)行。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 近紅外熒光碳量子點(diǎn)的制備

近紅外熒光碳量子點(diǎn)(NIRF-CQDs)按文獻(xiàn)[20] 方法并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)合成。簡(jiǎn)言之，先將3%的葡萄糖水溶液置于200 ℃的水熱反應(yīng)釜的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中加熱反應(yīng)4 h，取出自然冷卻至室溫，過(guò)濾、離心除去大顆粒，制得最大熒光發(fā)射峰位于440 nm 左右的碳量子點(diǎn)預(yù)備溶液。取制備的碳量子點(diǎn)預(yù)備溶液2 mL, 加入1%考馬斯亮藍(lán)溶液5 mL、1%乙二胺溶液2 mL，超聲5 min，加入40 mL 水，轉(zhuǎn)至水熱反應(yīng)釜中，在200 ℃下反應(yīng)4 h，取出自然冷卻至室溫，10 000 r·min-1離心10 min，過(guò)濾，然后在經(jīng)透析洗滌后，將透析袋中溶液旋轉(zhuǎn)蒸干，即得到熒光發(fā)射為744 nm的近紅外碳量子點(diǎn)，置于陰涼處備用。

2.2.2 金納米粒子的制備

金納米粒子(AuNPs)按文獻(xiàn)[21]方法以檸檬酸鈉還原氯金酸制備，即：取250 mL 0.1 mmol·L-1HAuCl4溶液置于潔凈的燒杯中，在劇烈攪拌下加熱至沸騰，然后迅速加入5 mL 38.8 mmol·L-1檸檬酸鈉，溶液顏色由淺黃變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)反應(yīng)30 min后冷卻至室溫。AuNPs 的濃度按文獻(xiàn)[22]方法測(cè)定為2.7 nmol·L-1。

2.2.3 金納米粒子表面修飾核酸適體

巰基修飾的核酸適體在金納米粒子進(jìn)行表面自組裝按文獻(xiàn)[23]方法進(jìn)行。取巰基修飾的Apt與TCEP(Apt∶TCEP=1∶5)混勻反應(yīng)1 h，即得活化的Apt；然后將活化的Apt與2.7 nmol·L-1AuNPs 混合，加入500 mmol·L-1酒石酸-HCl 緩沖溶液(pH=3.0)，在室溫下孵化30 min，轉(zhuǎn)至10 000 r·min-1離心25 min 除去未修飾到金納米粒子表面的Apt，再用pH=7.3的10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗，如此3次，得到Apt修飾的金納米粒子(AuNPs/Apt)，將其分散于水中，4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 AuNPs/Apt/NIRF-CQDs復(fù)合物的制備

將NIRF-CQDs與AuNPs/Apt在10 mmol·L-1pH=7.3 的PBS溶液中混合均勻，靜置反應(yīng)10 min，離心去除過(guò)量的NIRF-CQDs，沉淀再用二次蒸餾水洗滌，再離心，如此3次，得到AuNPs/Apt/NIRF-CQDs復(fù)合物，備用。

2.2.5 OTA測(cè)定

先將AuNPs/Apt/NIRF-CQDs復(fù)合物超聲分散至水中，測(cè)定其熒光強(qiáng)度；然后，向分散液中加入不同濃度的OTA(0～2.40 ng·mL-1)，混勻反應(yīng)5 min，測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度。按同樣的方法，向復(fù)合物分散液中加入其他真菌毒素(AFB1、AFB2、DON、FB1、OTB和ZEN)，進(jìn)行傳感器的選擇性試驗(yàn)，OTA的濃度為1.0 ng·mL-1，其他真菌毒素的濃度均為10 ng·mmol-1，以615 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定熒光發(fā)射光譜(最大發(fā)射波長(zhǎng)為744 nm)強(qiáng)度。光譜測(cè)定都在室溫下10 mmol·L-1PBS(pH=7.3)中進(jìn)行。所得數(shù)據(jù)均為3次測(cè)定平均值。

2.2.6 中藥材中OTA測(cè)定

中藥樣品經(jīng)研碎，過(guò)三號(hào)篩，稱取其粉末 5 g，加入70%甲醇溶液 50 mL，超聲30 min,以4 000 r·min-1離心5 min,取上層清液10 mL，用水稀釋至 20 mL,搖勻,即得試樣溶液。

取試樣溶液適量置于AuNPs/Apt/NIRF-CQDs分散溶液中，混勻，再加入PBS緩沖溶液，搖勻，孵化5 min，測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度，確定中藥材中OTA含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 碳量子點(diǎn)熒光特性

圖1是碳量子點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜。所制備的碳量子點(diǎn)具有很好的近紅外熒光發(fā)射特性，激發(fā)波長(zhǎng)位于615 nm時(shí), 所制備的碳量子點(diǎn)的熒光發(fā)射最強(qiáng)，其發(fā)射峰位于744 nm。以所合成的近紅外熒光碳量子點(diǎn)為探針檢測(cè)OTA，可以很好地避開內(nèi)源性物質(zhì)在可見(jiàn)光區(qū)的熒光發(fā)射，因此能有效地消除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

圖1 碳量子點(diǎn)的熒光光譜。a:激發(fā)光譜，b:發(fā)射光譜。

Fig.1 Fluorescence spectra of CQDs. a: Excitation spectrum. b: Emission spectra.

3.2 方法原理

金納米粒子具有強(qiáng)烈的熒光猝滅功能[24]。本工作以金納米粒子為熒光猝滅劑，以近紅外熒光碳量子點(diǎn)為熒光探針，構(gòu)建OTA傳感監(jiān)測(cè)平臺(tái)。先將巰基-OTA核酸適體與金納米粒子自組裝，形成AuNPs/Apt；再向AuNPs/Apt體系中加入NIRF-CQDs，通過(guò)靜電作用[25]，NIRF-CQDs與AuNPs/Apt自組裝生成AuNPs/Apt/NIRF-CQDs復(fù)合物，NIRF-CQDs熒光猝滅。向AuNPs/Apt/NIRF-CQDs復(fù)合物分散液體系中加入OTA時(shí)，Apt選擇性地與OTA反應(yīng)生成Apt-OTA復(fù)合物，同時(shí)釋放出NIRF-CQDs，體系熒光恢復(fù)(如圖2所示)。根據(jù)OTA的濃度與體系的熒光恢復(fù)程度之間的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)樣品中OTA的檢測(cè)。

圖2 金納米粒子/核酸適體/NIRF-CQDs+赭曲霉毒素A體系的熒光光譜

Fig.2 Fluorescence spectra of AuNPs/Aptamer/NIRF-CQDs+OTA

3.3 條件優(yōu)化

3.3.1 核酸適體用量的影響

研究了AuNPs/Apt復(fù)合物中Apt與AuNPs的量比對(duì)NIRF-CQDs熒光猝滅和恢復(fù)的影響，其猝滅程度如圖3所示。圖3顯示，Apt為AuNPs的50～150倍時(shí)，NIRF-CQDs的熒光猝滅隨Apt的比例增大而迅速增強(qiáng)；達(dá)到175～225倍時(shí)，體系熒光強(qiáng)度基本穩(wěn)定。185倍時(shí)，熒光猝滅達(dá)到最大值。

圖3 核酸適體與金納米粒子的量比對(duì)體系熒光猝滅的影響

Fig.3 Influence of aptamer and AuNPs in mole ratio on fluorescent quenching

向已發(fā)生熒光猝滅的體系中加入OTA樣品，體系熒光強(qiáng)度恢復(fù)情況與熒光猝滅的變化類似，與Apt的量有關(guān)。Apt用量較低時(shí)，熒光恢復(fù)程度隨Apt的用量增大而增大；Apt的用量為AuNPs的185倍時(shí)，體系熒光恢復(fù)程度達(dá)到最大，之后，熒光恢復(fù)測(cè)定Apt隨用量增大而降低。故在后續(xù)試驗(yàn)中選擇Apt的用量為AuNPs的185倍(量的比)。

3.3.2 pH值對(duì)體系熒光強(qiáng)度恢復(fù)的影響

由于NIRF-CQDs表面氨基對(duì)H+離子敏感，在酸性環(huán)境中NIRF-CQDs接受質(zhì)子，使熒光猝滅；同樣，在較高pH值(堿性)環(huán)境中，其表面氨基可以形成氫鍵，引起碳量子點(diǎn)的團(tuán)聚，也使熒光猝滅。因此，研究了弱酸性至弱堿性范圍(pH=4.0～9.0)體系熒光強(qiáng)度變化，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可知，在pH=4.0～6.5時(shí)，體系熒光強(qiáng)度隨pH升高而呈線性增大，這是由于隨體系pH增大，碳量子點(diǎn)表面接受質(zhì)子能力減弱所致；在pH=6.5～7.5范圍，體系熒光強(qiáng)度變化緩慢，且在pH=7.0～7.5時(shí)出現(xiàn)一穩(wěn)定的最大值平臺(tái)；之后又呈線性減弱變化，這是碳量子點(diǎn)團(tuán)聚所導(dǎo)致的熒光猝滅現(xiàn)象。在pH=7.0～7.5范圍內(nèi)，體系熒光變化對(duì)pH不敏感，因此， pH控制在該范圍內(nèi)，體系熒光強(qiáng)度有很好的重現(xiàn)性，并不受pH變化的影響，故在后續(xù)試驗(yàn)中，控制體系pH=7.3。

圖4 pH對(duì)體系熒光強(qiáng)度恢復(fù)的影響

Fig.4 Influence of pH on fluorescence intensity recovery in the system

3.3.3 孵化時(shí)間的影響

研究顯示，復(fù)合物中Apt能迅速地與OTA結(jié)合并釋放出NIRF-CQDs。室溫環(huán)境中，當(dāng)樣品與復(fù)合物混合，體系熒光強(qiáng)度迅速恢復(fù)，孵化5 min后，體系熒光強(qiáng)度不再增大，并在40 min 保持穩(wěn)定。后續(xù)試驗(yàn)中孵化時(shí)間定為5 min。

3.3.4 其他真菌毒素物的影響

圖5是OTA核酸適體傳感對(duì)OTA與其他真菌毒素的選擇性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，其他真菌毒素?zé)o干擾。因此，OTA核酸適體傳感可用于中藥材復(fù)雜體系中的OTA測(cè)定。

圖5 核酸適體傳感分析的選擇性，OTA為1.0 ng·mL-1，其余真菌毒素濃度為10 ng·mL-1。

Fig.5 Selectivity of the aptasensor assay, concentration of OTA: 1.0 ng·mL-1, others: 10.0 ng·mL-1.

3.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

取AuNPs/Apt/NIRF-CQDs分散液0.1 mL用10 mmol·L-1PBS(pH=7.3)稀釋至2 mL，測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度，記為F0；再分別依次向上述方法制備的溶液中加入不同濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液，孵化5 min，測(cè)定體系熒光，記為F；其熒光強(qiáng)度差值為體系熒光恢復(fù)程度y=F-F0。試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，體系的熒光強(qiáng)度隨著OTA的濃度增大而增強(qiáng)，并且，體系的熒光恢復(fù)程度y與OTA濃度在0.015～1.5 ng·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=1.816+123.4C(C為OTA的濃度，單位：ng·mL-1)，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 3，方法檢出限(3σ/k)為8 pg·mL-1。

圖6 體系的熒光強(qiáng)度隨OTA濃度(0,0.015,0.030,0.050,0.10,0.20,0.30,0.50,0.75,1.00,1.50 ng·mL-1)的變化情況。插圖：F-F0與OTA的濃度在0.015～1.5 ng·L-1范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。

Fig.6 Dependence of fluorescent intensity on the concentration of OTA(0, 0.015, 0.030, 0.050, 0.10, 0.20, 0.30, 0.50, 0.75, 1.00， 1.50 ng·mL-1). Inset shows the linear relationship between theF-F0and OTA concentration within the range of 0.015-1.50 ng·mL-1.

3.4 分析應(yīng)用

將所構(gòu)建的核酸適體傳感體系應(yīng)用于中藥材樣品中的 OTA 檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。

從表1 可知，所測(cè)樣品均不同程度地受到OTA污染，其中麥芽和甘草污染較為嚴(yán)重，表明麥芽和甘草易受OTA污染，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)它們的質(zhì)量監(jiān)控。另外，回收率和 RSD 的結(jié)果表明，該傳感體系適用于中藥材中殘留真菌毒素檢測(cè)。

表1 幾種中藥材樣品中 OTA的檢測(cè)

4 結(jié) 論

核酸適體、金納米粒子和NIRF-CQDs通過(guò)自組裝形成AuNPs/Apt/NIRF-CQDs核酸適體納米復(fù)合物，使復(fù)合物中近紅外熒光碳量子點(diǎn)的熒光猝滅，復(fù)合物中Apt與OTA特異性結(jié)合，釋放出NIRF-CQDs，使其熒光恢復(fù)，據(jù)此，建立了近紅外熒光測(cè)定OTA的新方法；而以近紅外熒光量子點(diǎn)為探針能有效地消除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，提高了檢測(cè)的選擇性。對(duì)連翹、麥芽、甘草等中藥材中的OTA進(jìn)行測(cè)定，顯示麥芽、甘草受OTA污染較為嚴(yán)重。該方法在實(shí)際樣品分析中的回收率在96.8%～104.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差小于5%，能滿足中藥材中微量OTA的檢測(cè)要求。