基于ERK-Calpain2通路探討黃連素對(duì)冠心病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響*

朱 娜，曹雪明

（1．河南省人民醫(yī)院健康管理科，鄭州 450000；2．河南省人民醫(yī)院心內(nèi)科，鄭州 450000）

冠心?。–HD）近年來(lái)發(fā)病率逐年上升且日趨年輕化，它最直接的影響就是心肌缺血從而導(dǎo)致心臟的供氧減少，不能支持心臟正常工作，甚至導(dǎo)致部分心肌細(xì)胞凋亡[1-2]。研究報(bào)道，黃連素（BBR）可能通過(guò)促進(jìn)抗氧化核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達(dá)對(duì)H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后的凋亡發(fā)揮顯著的抑制作用[3]。BBR可抑制細(xì)胞與調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2途徑減輕大氣細(xì)顆粒物對(duì)EA．hy926內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的損傷凋亡[4]。這些提示黃連素對(duì)包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡具有抑制作用。但BBR在抑制心肌細(xì)胞凋亡中的機(jī)制還不完善。因此，本研究通過(guò)建立CHD大鼠模型，觀察BBR對(duì)模型動(dòng)物心肌凋亡的作用，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量（200±20）g，常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：No．201722172。

1.2 試劑 BBR（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），腦垂體后葉素（南京新百藥業(yè)有限公司），含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3、Caspase-12、鈣蛋白酶（Calpain）2、鈣蛋白酶抑制蛋白（Capastatin）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）抗體及羊抗兔和羊抗鼠IgG-HRP二抗（美國(guó)CST公司），GAPDH抗體（Bioworld公司），RIPA裂解液、BCA試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）,PrimeScriptTM RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量試劑盒及引物（大連TaKaRa公司）,一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海Beyotime公司）。

1.3 主要儀器 PIPETMANL微量可調(diào)加樣器，法國(guó)Gilson公司；Allegra 64R Centrifuge臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司；CKX41倒置顯微鏡，日本Olympus公司；MiniVE電泳設(shè)備，美國(guó)GE公司；ABI Prism 7300型熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司。

1.4 動(dòng)物模型的建立及分組給藥 參考文獻(xiàn)[5]方法每日給予高脂食物連續(xù)喂養(yǎng)6周，間隔24 h腹腔注射垂體后葉素30 μg/kg，連續(xù)3次，建立CHD大鼠模型，并測(cè)定模型鼠心臟ST段變化，與正常鼠相比，心臟ST段變化明顯升高的模型鼠為造模成功。將模型動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究實(shí)驗(yàn)組予以80 mg/（kg·d）BBR灌胃；對(duì)照組每日予以等體積的雙蒸水灌胃。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)以正常SD大鼠設(shè)立空白組，予以等體積的雙蒸水灌胃。每組10只動(dòng)物，治療周期為12周。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）法檢測(cè)心肌細(xì)胞中GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA水平變化含量 采用大鼠的心肌組織，按照文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行RNA提取、純化、RT反應(yīng)和qPCR反應(yīng)并計(jì)算分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6 TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況 參考文獻(xiàn)[7]將收集好的心肌組織石蠟包埋、切片、蘇木素染核，將切面放入Tris-HCl（含3%牛血清白蛋白和20%牛血清）中15～25℃浸泡，后經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液（PBS）浸泡潤(rùn)洗2次，晾干，在切片上滴加50 μL TUNEL 反應(yīng)混合液，37℃孵育 1．5 h，PBS洗 3遍，稍微放干在倒置顯微鏡下觀察組織細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡率，隨機(jī)選取5個(gè)非重疊400倍鏡視野，計(jì)錄凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)，心肌細(xì)胞凋亡率=凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.7 蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)分析各組大鼠相對(duì)蛋白表達(dá)量 大鼠的心肌組織參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行蛋白提取、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，及封閉。按需求加入 Caspase-12 抗體（1∶1 000）、CHOP 抗體（1∶2 000）、GRP78 抗體 （1∶2 000）、Calpain2 抗體 （1∶1 000）、Capastatin抗體（1∶1 000）及 GAPDH（內(nèi)參）抗體 4℃溫育過(guò)夜。次日，TBST洗膜3次，再加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫雜交1 h，PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，用Syngene Imaging System進(jìn)行成像，用Image J對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Prism 7．0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差s）表示。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3 法，P＜0．05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物TUNEL染色結(jié)果 心肌TUNEL染色后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均發(fā)現(xiàn)了不同程度的深棕色凋亡細(xì)胞，見(jiàn)圖1。與空白組相比，對(duì)照組細(xì)胞凋亡明顯，凋亡率（27．8±3．1）顯著增加（P＜0．01）；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡（18．7±2．2）顯著減少（P＜0．01）。

圖1 各組大鼠心肌TUNEL染色（×200）Fig.1 Myocardial TUNEL staining of rats in each group（×200）

2.2 各組動(dòng)物Caspase-12、Caspase-3蛋白表達(dá)變化 與空白組相比，Caspase-12和Caspase-3蛋白均明顯上調(diào)（P＜0．01），而與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組上述蛋白均有不同程度下調(diào)（P＜0．01）。見(jiàn)圖2A和表1。

圖2 各組大鼠心肌Caspase-12、Caspase-3、GRP78和CHOP相對(duì)蛋白表達(dá)水平Fig.2 Elative protein expression levels of Caspase-12,Caspase-3,GRP78 and CHOP in myocardium of rats in each group

表1 各組大鼠心肌Cleaved caspase-12、Cleaved caspase-3、GRP78 和 CHOP 相對(duì)蛋白表達(dá)水平（Tab.1 Relative protein expression levels of Cleavedcaspase-12,leaved-caspase-3,GRP78 and CHOP in myocardium of rats in each group（%

表1 各組大鼠心肌Cleaved caspase-12、Cleaved caspase-3、GRP78 和 CHOP 相對(duì)蛋白表達(dá)水平（Tab.1 Relative protein expression levels of Cleavedcaspase-12,leaved-caspase-3,GRP78 and CHOP in myocardium of rats in each group（%

注：與空白組比較，*P＜0．01；與對(duì)照組比較，#P＜0．01。

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2.3 各組動(dòng)物GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA水平變化 與空白組相比，對(duì)照組GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA 表達(dá)明顯升高（P＜0．01），而與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA表達(dá)下降（P＜0．05）。見(jiàn)圖 3。

圖3 各組大鼠心肌GRP78、CHOP和calpain2 mRNA表達(dá)水平Fig.3 Relative mRNA expression levels of GRP78,CHOP and Calpain2 in myocardium of rats in each group

2.4 各組動(dòng)物GRP78、CHOP蛋白表達(dá)變化 與空白組相比，對(duì)照組GRP78和CHOP蛋白均明顯上調(diào)（P＜0．01）；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組上述蛋白均有不同程度下調(diào)（P＜0．01）。見(jiàn)圖 2B 和表 2。

表2 各組大鼠心肌Calpain2、Calpastatin和p-ERK相對(duì)蛋白表達(dá)水平（Tab.2 Relative protein expression levels of Calpain2,Calpastatin and p-ERK in myocardium of rats in each group（%

表2 各組大鼠心肌Calpain2、Calpastatin和p-ERK相對(duì)蛋白表達(dá)水平（Tab.2 Relative protein expression levels of Calpain2,Calpastatin and p-ERK in myocardium of rats in each group（%

注：與空白組比較，*P＜0．01；與對(duì)照組比較，#P＜0．01。

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2.5 各組動(dòng)物p-ERK、Calpain2和Capastatin蛋白表達(dá)變化 與空白組相比，對(duì)照組p-ERK和Calpain2 蛋白均明顯上調(diào)（P＜0．01），Capastatin 蛋白表達(dá)下降；而與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組p-ERK和Calpain2蛋白表達(dá)下調(diào)，Capastatin蛋白表達(dá)升高（P＜0．01），見(jiàn)圖 4 和表 2。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是凋亡的主要途徑之一，短期的ERS會(huì)導(dǎo)致抗凋亡的GRP78表達(dá)上調(diào)，而長(zhǎng)期ERS會(huì)促進(jìn)CAAT/CHOP以及胱天蛋白酶12剪切體（Cleaved-caspase-12）表達(dá)升高[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHD模型大鼠心肌Cleaved caspase-12、GRP78和CHOP表達(dá)升高，同時(shí)凋亡的執(zhí)行者Caspase-3剪切體（Cleaved caspase-3）增加。提示，模型動(dòng)物心肌出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡。研究表明，Calpain2為Caspase-12的上游信號(hào)分子[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型大鼠Calpain2表達(dá)上調(diào)，而Calpastatin表達(dá)下調(diào)，提示Calpain2的表達(dá)和活性增強(qiáng)。近期研究發(fā)現(xiàn)，砷誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡伴隨著Calpain2的激活和ERK的磷酸化增強(qiáng)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)模型動(dòng)物p-ERK升高，Chen等[12]報(bào)道ERK為Calpain的上游信號(hào)靶點(diǎn)，p-ERK表達(dá)升高能提高Calpain活性，這些提示CHD大鼠心肌細(xì)胞可能通過(guò)ERK-Calpain2信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡。

圖4 各組大鼠心肌Calpain2、Calpastatin和p-ERK相對(duì)蛋白表達(dá)水平Fig.4 Relative protein expression levels of Calpain2,Calpastatin and p-ERK in myocardium of rats in each group

本研究實(shí)驗(yàn)組以BBR灌胃治療后發(fā)現(xiàn)，模型動(dòng)物心肌ERS標(biāo)志物Cleaved caspase-12、GRP78和CHOP表達(dá)下降，凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved caspase-3表達(dá)減弱。提示BBR能抑制CHD大鼠心肌發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡，而進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)心肌Calpain2表達(dá)下調(diào)，Calpastatin上調(diào)，p-ERK蛋白下調(diào)，提示ERK-Calpain2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱。

綜上所述，BBR能抑制CHD大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡，該作用可能與抑制ERKCalpain2信號(hào)通路有關(guān)。