富血小板纖維蛋白對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖、凋亡及堿性磷酸酶活性的影響

項(xiàng)海東，田松波，陳惠珍

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 口腔內(nèi)科，河北 石家莊 050000）

牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells, DPSCs）來(lái)自于成年機(jī)體的牙髓組織，是具有多向分化潛能和自我更新的未分化細(xì)胞。正常情況下，DPSCs處于靜息狀態(tài)，維持牙髓中細(xì)胞的功能及新舊交替的穩(wěn)態(tài)，當(dāng)牙髓中的成牙本質(zhì)細(xì)胞受到損傷后，DPSCs可參與牙髓的修復(fù)與重建。因此，DPSCs被認(rèn)為是影響牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體形成的理想種子細(xì)胞[1-2]。目前已發(fā)現(xiàn)多種在體內(nèi)及體外影響DPSCs增殖及分化的因素。富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin, PRF）是新一代的血小板濃縮制品，富含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等多種生長(zhǎng)因子，這些因子可構(gòu)成強(qiáng)大的組織修復(fù)功能調(diào)節(jié)系統(tǒng)，目前已被應(yīng)用于基礎(chǔ)細(xì)胞的研究[3-4]。但PRF對(duì)DPSCs的影響及機(jī)制尚不清楚。因此，本研究旨在探討PRF對(duì)DPSCs的增殖、分化、凋亡的影響及機(jī)制，以期為牙髓再生帶來(lái)新的契機(jī)。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting Kit-8,CCK8）、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫/碘化丙錠（propidium iodide, PI）凋亡試劑盒均購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所，活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Cleaved Caspase-3）、p38、p-p38單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)abcam公司，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。RT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)SIM公司，倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，酶標(biāo)儀、電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 人牙髓干細(xì)胞（hDPSCs）的分離培養(yǎng)

收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科志愿者（16～25歲）阻生第3磨牙，即刻放入預(yù)冷及加入青鏈霉素雙抗的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)保存。無(wú)菌條件下取出牙髓組織，用0.01 mol/L的PBS清洗2次，小剪刀將牙髓組織剪成1～2 mm的小組織塊，按照1∶1比例加入0.4%的分散酶和0.3%的Ⅰ型膠原酶，37℃消化1 h，輕輕吹打離散單細(xì)胞團(tuán)塊，過(guò)70 μm的細(xì)胞篩網(wǎng)，1 000 r/min離心5 min，0.01 mol/L的PBS清洗1遍。細(xì)胞沉淀用高糖DMEM培養(yǎng)基（含20%的胎牛血清）重懸，以1×105個(gè)/ml密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO2，95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%～90%時(shí)，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后傳代。收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的第2代hDPSCs進(jìn)行純化后再用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 PRF的制備

血液來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科10例健康的志愿者，平均26歲（22～28歲），均簽署知情同意書。無(wú)菌條件下每個(gè)志愿者抽取5 ml靜脈血于真空管中，3 000 r/min離心10 min，靜置數(shù)分鐘后，棄去上清，收集中間層（中間層為PRF），將PRF凝膠與試管底部的紅細(xì)胞分離出來(lái)，所獲得的PRF膜用來(lái)制備滲出液。將PRF膜放置在預(yù)先盛有2 ml/孔的DMEM培養(yǎng)基的6孔板中，1孔/板，培養(yǎng)板置于孵育箱中繼續(xù)孵育，4℃放置7 d后收集6孔板中的培養(yǎng)液，3 000 r/min離心15 min以沉淀紅血細(xì)胞，然后使用0.22 μm的無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌。將收集的PRF浸出液分裝，置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)

hDPSCs隨機(jī)分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組。將第3代hDPSCs以1×104個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃，5% CO2，95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)第1、3、5及7天時(shí)，每孔細(xì)胞中加入10 μl的CCK-8溶液，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定并記錄各組的光密度（OD）值。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A）×100%。

1.5 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)

hDPSCs隨機(jī)分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組。每組設(shè)置第 0、3、7、14天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)。以2×104個(gè)/ml的密度將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的第4代hDPSCs的單細(xì)胞懸液接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間后，用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，RT-PCR檢測(cè)ALP的mRNA表達(dá)。ALP引物序列：正向：5'-GGCTGGA GATGGACAAGTTC-3'，反向：5'-CTCGTTTCCCTGAGT CGTGT-3'；GAPDH引物序列：正向：5'-AAGAGTGGG TTTAAGTGGAAGGCT-3'，反向：5'-GAAGATGGTGAT GGGATTTC-3'。PCR反應(yīng)參數(shù)：A，預(yù)變性 95℃10 min；B，變性95℃ 10 s；退火60℃ 15 s，延伸72℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)；C，72℃ 15 min。4℃終止反應(yīng)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取均值采用2-△△Ct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

收集按照上述分組培養(yǎng)第7天的細(xì)胞，預(yù)冷的PBS及結(jié)合緩沖液各洗滌細(xì)胞1次后，離心棄上清，加入400 μl的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，細(xì)胞沉淀加入5 μl的PI和Annexin-V-FITC，充分混勻后置于室溫下避光孵育10～15 min，離心沉淀細(xì)胞，緩沖液洗滌細(xì)胞1次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blotting檢 測(cè) Cleaved Caspase-3、p38、p-p38蛋白表達(dá)

收集按照上述分組培養(yǎng)第7天的細(xì)胞，按照細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中的蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)提取的蛋白質(zhì)量。將蛋白樣品與上樣緩沖液等量混勻后置于100℃變性10 min，依次進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育Cleaved Caspase-3、p38、p-p38 1∶400稀釋，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH），1∶1 000稀釋、二抗孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，1∶1 000稀釋，37℃孵育1 h，洗膜3次，ECL發(fā)光劑顯影，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以GAPDH作為內(nèi)參，分析Cleaved Caspase-3、p38、p-p38的蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，兩組多時(shí)間點(diǎn)的比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PFR對(duì)hDPSCs增殖的影響

對(duì)照組在第0、1、3、5及7天的OD值分別為（0.18±0.04）、（0.25±0.06）、（0.36±0.07）、（0.48±0.08）、（0.63±0.09），實(shí)驗(yàn)組在第 0、1、3、5 及 7 天的 OD 值分別為（0.20±0.05）、（0.28±0.07）、（0.59±0.08）、（0.73±0.09）、（0.90±0.08）。對(duì)照組與PRF組第0、1、3、5及7天的OD值比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的OD值有差異（F=13.243，P=0.000）；②對(duì)照組與PRF組OD值有差異（F=17.276，P=0.000）；③對(duì)照組與PRF組OD值變化趨勢(shì)有差異（F=19.417，P=0.000）。見圖1。

圖1 PFR對(duì)hDPSCs增殖的影響 （±s）

2.2 PFR對(duì)hDPSCs礦化相關(guān)基因ALP表達(dá)的影響

對(duì)照組在第0、3、7及14天ALP mRNA表達(dá)分別為（0.883±0.112）、（1.231±0.163）、（1.624±0.152）、（1.913±0.164），實(shí)驗(yàn)組分別為（0.925±0.144）、（1.284±0.192）、（2.422±0.321）、（2.695±0.371），兩組第 0、3、7及14天ALP mRNA表達(dá)比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)間ALP mRNA表達(dá)有差異（F=17.191，P=0.000）；②兩組ALP mRNA表達(dá)有差異（F=19.841，P=0.000）；③兩組ALP mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)有差異（F=18.358，P=0.000）。見圖2。

圖2 PFR對(duì)hDPSCs的ALP mRNA表達(dá)的影響 （±s）

2.3 PFR對(duì)hDPSCs凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率（4.18±0.67）%較對(duì)照組（13.21±1.02）% 下降（t=12.816，P=0.000）。見圖 3。

圖3 PFR對(duì)hDPSCs凋亡的影響

2.4 PFR對(duì)Cleaved Caspase-3、p38、p-p38蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組Cleaved Caspase-3、p38、p-p38的蛋白表達(dá)分別為（0.162±0.023）、（0.668±0.046）、（0.041±0.016），實(shí)驗(yàn)組Cleaved Caspase-3、p38、p-p38的蛋白表達(dá)分別為（0.063±0.016）、（0.681±0.051）、（0.174±0.019），實(shí)驗(yàn)組Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)（t=0.120，P=0.004）、p-p38蛋白表達(dá)上調(diào)（t=9.274，P=0.001），p38蛋白在兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.328，P=0.760）。見圖 4。

圖4 PFR對(duì)Cleaved Caspase-3、p38、p-p38蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近些年來(lái)，利用干細(xì)胞治療已成為再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[5]。干細(xì)胞可分為成體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。DPSCs是成體干細(xì)胞的一員，可分化為脂肪干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞，也可形成牙本質(zhì)牙髓細(xì)胞。牙本質(zhì)牙髓細(xì)胞是未來(lái)牙形成的第一步，這也說(shuō)明DPSCs在活髓的保存及治療中有臨床應(yīng)用價(jià)值及潛在的優(yōu)勢(shì)[5]。PRF是繼富血小板血漿（platelet rich plasma, PRP）后的新一代血小板濃縮制品，富含纖維蛋白原、多種生長(zhǎng)因子及高濃度的血小板，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞等的增殖、分化等過(guò)程[6]。研究顯示，PRF可在體外促進(jìn)牙槽骨成骨細(xì)胞的增殖及分化，可以不同的方式促進(jìn)犬DPSCs的增殖及分化[7-8]。ALP是一種磷酸單酯水解酶，是成骨細(xì)胞成熟的早期標(biāo)志物之一，參與骨的形成及代謝過(guò)程，其活性的增強(qiáng)是DPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的早期標(biāo)志[9]。本研究結(jié)果顯示，PRF可促進(jìn)DPSCs的增殖和分化。

細(xì)胞凋亡過(guò)程受到Caspase家族的調(diào)控，Caspase-3是Caspase家族的一員，是細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵性的活化酶，處在Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，其激活可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[10]。研究顯示，Caspase-3的激活可引起DPSCs的凋亡[11]。本研究結(jié)果顯示，PRF可抑制DPSCs的凋亡及下調(diào)Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)。

絲裂原活性蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）屬于絲蛋白/蘇氨酸激酶，參與細(xì)胞的增殖及死亡、基因表達(dá)調(diào)控等過(guò)程，在多種信號(hào)的傳遞過(guò)程中有重要作用[12]。p38 MAPK信號(hào)通路是MAPK信號(hào)通路家族中重要一員，參與牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化等過(guò)程[13]。研究顯示，阿司匹林可通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)通路抑制DPSCs的增殖及分化[14]。p38 MAPK信號(hào)通路抑制劑可抑制ALP的活性和成牙本質(zhì)樣細(xì)胞的分化，在初期牙本質(zhì)及第3期反應(yīng)性牙本質(zhì)形成過(guò)程中，可發(fā)現(xiàn)p38 MAPK信號(hào)通路的激活[15]。本研究結(jié)果顯示，PRF可上調(diào)p-p38蛋白的表達(dá)。

綜上所述，PRF可通過(guò)激活p38信號(hào)通路促進(jìn)hDPSCs的增殖，上調(diào)ALP mRNA表達(dá)，抑制其凋亡。該研究為牙髓損傷修復(fù)及再生帶來(lái)了新的思路。