厚樸正丁醇提取部位藥效活性及咽喉刺激性研究

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(1.武漢市第八醫(yī)院,湖北 武漢 430010;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430065;3.武漢華夏理工學(xué)院,湖北 武漢 430223 )

厚樸為木蘭科植物厚樸(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.)或凹葉厚樸(Magnolia officinalis Rehd.et wils.var.biloba Rehd.et Wils.)的干燥干皮、根皮及枝皮[1]。味苦、辛，性溫，具有燥濕消痰，下氣除滿(mǎn)的功效，是臨床常用中藥。厚樸生品峻烈，刺激咽喉，姜炙厚樸可達(dá)到減小咽喉刺激性，增強(qiáng)寬中和胃的功效，故臨床上一般用姜炙品而不用其生品[2-3]。厚樸主要化學(xué)成分為木脂素類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、生物堿成分[4-5]，目前研究較多的集中在炮制前后有效成分的含量變化及乙酸乙酯、石油醚等弱極性部[6]的研究上，鮮有對(duì)厚樸正丁醇提取部位成分的藥效活性及咽喉刺激性的研究。正丁醇極性跨度較大，能提取較多成分。本文旨在用前期優(yōu)選的提取方法，制備厚樸正丁醇提取部位樣品，對(duì)該部位成分進(jìn)行咽喉刺激性和胃腸功能影響研究，綜合探討炮制前后正丁醇部位藥效活性及刺激性成分的變化，以期為姜制厚樸炮制機(jī)理研究提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

TGL-16gR飛鴿高速冷凍離心機(jī)(飛鴿儀器) ,HH6003放射性免疫分析儀((北京核海高技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)，胃泌素放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)。

1.2 試藥與實(shí)驗(yàn)材料

凈厚樸、姜厚樸(厚樸采自陜西商洛，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)張林壁教授鑒定為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.的干皮、根皮和枝皮，由劉艷菊教授按照炮制規(guī)范制備樣品)，凈厚樸、姜厚樸正丁醇提取部位(自制，浸膏得率分別為3.5%、4.3%)，聯(lián)邦止咳露(深圳致君制藥有限公司，批號(hào)：130612)、 嗎丁啉(西安楊森制藥有限公司,批號(hào):131030209)、鹽酸雷尼替丁膠囊(江西匯仁藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1310024)、活性炭末、阿拉伯膠、吐溫-80(均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)。

根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版記載，厚樸飲片入藥劑量為3～9g·d-1[1]，本實(shí)驗(yàn)中以9g作為成人每天用藥劑量。嗎丁啉成人劑量為150mg·d-1，成人體重以60kg計(jì)，小鼠以20g計(jì)，小鼠的給藥劑量設(shè)為低、中、高三種劑量，分別為成人最高劑量的1、2、3倍。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)健康昆明種小鼠，雌雄各半，體重20±2g,購(gòu)于武漢市疾病防控中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK鄂2004-0015。

1.4 藥液的制備

供試品溶液的制備 低、中、高三種劑量分別為成人最高劑量的1、2、3倍。分別稱(chēng)取3種劑量?jī)艉駱?、姜厚樸正丁醇部位提取物，用溶劑溶解，制備成含凈厚樸、姜厚樸的低、中、高三個(gè)濃度的溶液，備用。

聯(lián)邦止咳露溶液的制備，取聯(lián)邦止咳露(磷酸可待因)適量 ,加蒸餾水適量,配制成濃度約為0.6g·L-1。

嗎丁琳試劑的制備 取嗎丁琳(多潘立酮片)數(shù)片，置研缽內(nèi)，研成細(xì)粉，然后加入蒸餾水,攪拌均勻，配置成1.75g·L-1的溶液,備用。

鹽酸雷尼替丁溶液的制備 取鹽酸雷尼替丁膠囊數(shù)粒。除去外殼，加入蒸餾水適量，攪拌均勻,配制成2.275g·L-1的溶液，備用。

炭末糊的制備 分別取阿拉伯膠1g、活性炭粉末2g，慢慢加入20mL的蒸餾水，一起慢慢研磨，至完全混均，轉(zhuǎn)移到燒杯中，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 咽喉刺激性研究

2.1.1 供試品溶液的制備

分別稱(chēng)取3種劑量?jī)艉駱恪⒔駱阏〈疾课惶崛∥?，用雙蒸水溶解，制備成含凈厚樸13.1g·L-1、19.65g·L-1、26.2g·L-1，含姜厚樸16.1g·L-1、24.15g·L-1、32.2g·L-1的低、中、高三個(gè)濃度的溶液，備用。

2.1.2 動(dòng)物與分組

小鼠80只，雌雄各半，體重為20(±2)g，隨機(jī)分為8組，每組10只，①陰性組(0.9%生理鹽水)，②嗎丁啉組(0.045g·kg-1)，③～⑤凈厚樸正丁醇低、中、高劑量組(0.0655、0.0982、0.131g·kg-1),⑥～⑧姜厚樸正丁醇低、中、高劑量組(0.0805、0.121、0.161g·kg-1)低、中、高三個(gè)濃度的溶液，備用。

2.1.3 咽喉刺激性實(shí)驗(yàn)

各組小鼠每天ig給藥2次，每次0.4mL，連續(xù)3 d，最后1次給藥后30min，將小鼠放入容積500mL的玻璃鐘罩內(nèi)，通過(guò)空氣壓縮機(jī)連接玻璃噴霧頭，以適當(dāng)恒壓將氨水(25%～28%氫氧化銨)均勻地噴入鐘罩內(nèi)，持續(xù)5s，觀(guān)察和記錄小白鼠咳嗽潛伏期及3min內(nèi)的咳嗽次數(shù)[2]。

2.1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組的咳嗽潛伏期和3min內(nèi)咳嗽次數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 凈、姜厚樸正丁醇部位對(duì)氨水致小鼠咳嗽的影響(x±s，n=10)Table 1 The effect of mice concentrated ammonia induced cough model on Magnolia officinalis N-butanol part is before and after processing(x±s，n=10)

備注：與陰性組比較1)P<0.01，與姜厚樸對(duì)應(yīng)劑量組比較2)P<0.05。

與陰性組對(duì)比，聯(lián)邦止咳露組及姜炙厚樸高、中、低劑量組均能顯著延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期，并減少咳嗽次數(shù)(P<0.01)。凈厚樸組對(duì)濃氨所致小鼠咳嗽無(wú)顯著性差異，但高、中、低劑量組均能一定程度延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期及減少咳嗽次數(shù)。 姜厚樸較凈厚樸更明顯的延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)(P<0.05)。

2.2 胃腸動(dòng)力實(shí)驗(yàn)

2.2.1 供試品溶液的制備

分別稱(chēng)取3種劑量?jī)艉駱?、姜厚樸正丁醇部位提取物，用雙蒸水溶解，制備成含凈厚樸3.238g·L-1、6.475g·L-1、9.712g·L-1，含姜厚樸3.978g·L-1、7.955g·L-1、11.932g·L-1的低、中、高三個(gè)濃度的溶液，備用。

2.2.2 動(dòng)物及分組

小鼠80只,雌雄各半，隨機(jī)分為8組，每組10只，①陰性組(0.9%生理鹽水)，②嗎丁啉組(0.035g·kg-1)，③～⑤凈厚樸正丁醇低、中、高劑量組(1.85、3.70、5.55g·kg-1),⑥～⑧姜厚樸正丁醇低、中、高劑量組(1.85、3.70、5.55g·kg-1)。

2.2.3 小腸推進(jìn)率的測(cè)定

各組小鼠每天ig給藥1次，每次0.4mL，連續(xù)3d。末次給藥前18h禁食不禁水，最后1次給藥1h后，小鼠ig給予黑色炭末糊0.4mL，20min后脫頸椎處死小鼠，迅速眼球取血，置EP管備用[7-8]。

小心開(kāi)腹，迅速取出小腸,輕輕剝離腸系膜后將小腸拉直，測(cè)量幽門(mén)至回盲部的小腸全長(zhǎng)及幽門(mén)至黑色半固體糊前沿的距離，計(jì)算小腸推進(jìn)率。

2.2.4 血清胃泌素的測(cè)定

將上述待用血液于4～5℃ 3500r·min-1離心10min分離血清，用放射免疫法測(cè)定血清中胃泌素含量(按放射性免疫試劑盒方法操作)。

2.2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

用SpSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 凈厚樸、姜厚樸正丁醇提取部位對(duì)小鼠小腸推進(jìn)率及胃泌素水平的影響 (x±s,n=10)Table2 The effect of n-butanol extract part in Jing Magnolia officinalis and Jiang Magnolia officinalis on the small intestine promotion rate and the serum gastrin level in mice (x±s,n=10)

注：與陰性組比較 ,1)P<0.05，2)P<0.01。

(1)小腸推進(jìn)率試驗(yàn)結(jié)果顯示，各劑量給藥組與陰性組比較，小腸推進(jìn)率效果顯著增加(P<0.05)，其中凈厚樸低、高兩個(gè)劑量組、姜厚樸低劑量組作用更明顯(P<0.01)。高劑量的姜厚樸在小腸推進(jìn)率上明顯優(yōu)于對(duì)應(yīng)劑量?jī)艉駱?，且高劑量存在顯著性差異。

(2)血清胃泌素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 與陰性組比較，嗎丁啉陽(yáng)性組、姜厚樸低、中、高各劑量組都能顯著促進(jìn)小鼠胃泌素的釋放，提高胃腸消化功能，具有顯著性差異(P<0.05)。凈厚樸各劑量組對(duì)陰性組雖沒(méi)有顯著性差異，但具有不同程度的促進(jìn)分泌作用，姜厚樸組藥效高劑量>中劑量>低劑量，姜厚樸各劑量組的效果優(yōu)于同劑量的凈厚樸組。

2.3 HCl性胃潰瘍實(shí)驗(yàn)

2.3.1 供試品溶液的制備

分別稱(chēng)取3種劑量?jī)艉駱?、姜厚樸正丁醇部位提取物，?%吐溫-80的雙蒸水溶解，制備成含凈厚樸2.935g·L-1、5.87g·L-1、8.805g·L-1，含姜厚樸3.978g·L-1、7.955g·L-1、11.932g·L-1的低、中、高三個(gè)濃度的溶液，備用。

2.3.2 動(dòng)物與分組

小鼠64只，雌雄各半，體重為20(±2)g，隨機(jī)分成8組，每組8只，①陰性組(0.9%生理鹽水)，②嗎丁啉組(0.045g·kg-1)，③～⑤凈厚樸正丁醇低、中、高劑量組(2.389、4.777、7.165g·kg-1),⑥～⑧姜厚樸正丁醇低、中、高劑量組(2.935，5.87，8.805g·kg-1)低、中、高三個(gè)濃度的溶液，備用。

2.3.3 胃潰瘍?cè)囼?yàn)的測(cè)定

各組小鼠每天ig給藥1次，每次0.4mL，連續(xù)3d ，末次給藥前24h禁食不禁水，最后1次給藥1h后，小鼠ig給予0.6mol·mL-1鹽酸，1h后眼球取血后脫頸椎處死，血液離心取血清待用[9]。

小心解剖出胃，用剪刀沿胃大彎剪開(kāi)，用生理鹽水清洗，應(yīng)激性胃潰瘍?cè)谖覆垦刂茏咝蟹植迹砻娓采w凝血，用濾紙擦拭凝血后鏡檢，以深褐色條索狀潰瘍的長(zhǎng)度總和(mm)表示條狀損害，計(jì)算潰瘍抑制百分率(%)。

2.3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

表3 凈厚樸、姜厚樸正丁醇提取部位對(duì)鹽酸胃潰瘍潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率比較(x±s,n=8)Table3 Comparison of the ulcer index and ulcer inhibitory rate of n-butanol extract part in Jing Magnolia officinalis and Jiang Magnolia officinalis (x±s,n=8)

備注：與陰性組比較1)P<0.01，與姜厚樸對(duì)應(yīng)劑量組比較;2)P<0.05。

與陰性組比較，各給藥組潰瘍指數(shù)均顯著性降低，具有顯著性差異(P<0.01)。說(shuō)明各給藥組對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性HCL潰瘍均有一定抑制功能。姜厚樸較凈厚樸對(duì)潰瘍抑制率具有顯著性提高，對(duì)應(yīng)劑量的效果具有顯著性差異(P<0.05)。

3 討論

(1)厚樸生品峻烈，刺激咽喉，姜炙厚樸可達(dá)到減小咽喉刺激性，增強(qiáng)寬中和胃的功效。研究結(jié)果表明，厚樸姜炙后其正丁醇提取部位能顯著延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期和減少咳嗽次數(shù)，且效果顯著優(yōu)于模型組，凈厚樸正丁醇提取部位作用較弱，姜厚樸正丁醇提取部位較凈厚樸的刺激性明顯減低，厚樸的刺激性成分，有人認(rèn)為并非其揮發(fā)油[5]，本實(shí)驗(yàn)證明，刺激性的降低可能與厚樸正丁醇部位某些生物堿成分的減少有關(guān)，故降低刺激機(jī)理尚待進(jìn)一步研究 。

(2)通過(guò)研究，厚樸姜炙前后其正丁醇提取部位對(duì)促進(jìn)小腸推進(jìn)率、胃泌素釋放和潰瘍抑制率的作用，均優(yōu)于模型組，說(shuō)明厚樸飲片正丁醇部位對(duì)小腸胃腸功能均有促進(jìn)作用。

(3)研究發(fā)現(xiàn)，各給藥組對(duì)血清胃泌素含量影響不顯著，只有姜厚樸的各劑量組與陰性對(duì)照組存在顯著性差異，姜厚樸各劑量組的效果優(yōu)于同劑量的凈厚樸組。這可能與胃腸運(yùn)動(dòng)受胃泌素、胃動(dòng)素、腸肽、P物質(zhì)有關(guān)[10-11]。

(4)在促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)功能上，高劑量的姜厚樸明顯優(yōu)于對(duì)應(yīng)劑量上凈厚樸，且高劑量存在顯著性差異，但與陽(yáng)性組對(duì)照，無(wú)顯著性差異。在潰瘍抑制率上，姜厚樸較凈厚樸對(duì)潰瘍抑制率具有顯著性提高。

(5)對(duì)比厚樸姜炙前后不同提取部位的藥效學(xué)研究中，正丁醇提取部位與乙酸乙酯提取部位[6]對(duì)潰瘍抑制率具有一致性，對(duì)小腸推進(jìn)率上正丁醇部位優(yōu)于乙酸乙酯部位，這可能與正丁醇部位成分的極性有關(guān)，為今后就正丁醇部位成分研究，以及進(jìn)一步闡明厚樸炮制機(jī)理奠定基礎(chǔ)。