納米材料修飾電極對(duì)辣根過(guò)氧化物酶新型生物傳感器性能影響研究綜述

胡 冰，張振東，張馨元，李 瑾，王 越,寧艷娜,肖保林,洪 軍

(河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開(kāi)封 475000)

辣根過(guò)氧化物酶(HRP)是過(guò)氧化物酶中最重要的化合物，被各個(gè)行業(yè)廣泛應(yīng)用。其一直被作為研究過(guò)氧化物酶的代表性酶，特別是在生物傳感器方面，近年來(lái)，用不同材料修飾的HRP的直接電化學(xué)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)其機(jī)制和性能的研究。

納米材料因具有大的比表面積、高的表面自由能、良好的生物相容性，及富含表功能基團(tuán)等特性，使得其能將大量生物分子固定到電極表面實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)內(nèi)部活性中心與電極表面的直接電子傳遞。不同疏水性的納米材料對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)部與電極表面的電子傳遞，可以通過(guò)電化學(xué)工作站探究生物傳感器性能的變化，從而總結(jié)納米材料疏水性對(duì)過(guò)氧化氫生物傳感器性能的影響規(guī)律。

1 碳納米管修飾電極

不同材料修飾的電極對(duì)過(guò)氧化氫生物傳感器的性能有著不同的影響。姚慧等[1]制備的Gel-MWCNTs-HRP/GCE全修飾電極，在0.1mol/L PBS(pH值6.0)緩沖溶液中運(yùn)用循環(huán)伏安法測(cè)試修飾電極，研究表明：全修飾電極對(duì)H2O2有很好的響應(yīng)。

鐘薇等[2]用考馬斯亮藍(lán)和多壁碳納米管的混合物使HRP固定在玻碳電極上，來(lái)研究酶與電極之間的電子傳遞和對(duì)H2O2的電催化活性。

姚慧，李小紅等[3]用三種不同的材料制備的新型碳糊電極，將HRP修飾在其表面(HRP-MWCNTs-CILE)，用不同方法研究了全修飾電極的電化學(xué)機(jī)制。結(jié)果表明，加入過(guò)氧化

氫使得新型修飾碳糊電極直接電化學(xué)的循環(huán)伏安圖發(fā)生了很大的變化，氧化還原峰值變高。說(shuō)明了HRP對(duì)過(guò)氧化氫的還原性有著較強(qiáng)的催化性能。

蔡稱(chēng)心，陳靜[4]將HRP固定在碳納米管修飾玻碳電極CNT/GC上，形成HRP-CNT/GC 電極。其材料簡(jiǎn)單操作方便快捷，并且還有一對(duì)準(zhǔn)可逆的氧化還原峰。

以上研究表明，碳納米管制備的電極易操作，并且與HRP有著良好的電子轉(zhuǎn)移。檢測(cè)方便，快速，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

2 納米金修飾電極

納米金(GNs)是多年來(lái)許多領(lǐng)域都在研究的材料，在醫(yī)學(xué)免疫、流式細(xì)胞儀、生物傳感器等方面都取得了優(yōu)異的成績(jī)。能與一些生物大分子結(jié)合，不影響其活性。

張凌燕等人[5]以NWCNT為基底，Nano-Au為交聯(lián)劑固定雙層HRP制備成H2O2的傳感器。用循環(huán)伏安法對(duì)電極HRP/Nano-Au/HRP/NNWCNT/GC進(jìn)行研究。

陳賢光等人[6]利用納米金(GNs)、硫堇(Thio)與HRP他們之間的共價(jià)鍵作用自組裝成的混合物，最后用殼聚糖(Chit)覆蓋構(gòu)建成一種新型的的生物傳感器。在此方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，與葡萄糖氧化酶結(jié)合形成雙酶體系葡萄糖傳感器，對(duì)葡萄糖的響應(yīng)進(jìn)行定量檢測(cè)。

李書(shū)芳，張思宇等[7]將納米金沉積在MWCNTs-CNs復(fù)合材料表面，以固定過(guò)氧化物酶，制得HRP/Au/MWCNTs-CNs/GCE修飾電極。據(jù)Au/MWCNTs-CNs/GC和HRP/Au/MWCNTs-CNs/GCE不同修飾電極在含0.5 mml/L H2O2的PBS(pH值 7.0)的電化學(xué)行為，結(jié)果表明HRP/Au/MWCNTs-CNs/GC效果最佳，具有很好的H2O2還原峰電流，表明HRP被成功固定并保持其生物活性。

以上研究表明，納米金具有一定的催化活性，使得納米金和辣根過(guò)氧化物酶制備出新的生物傳感器對(duì)過(guò)氧化氫有良好的電化學(xué)響應(yīng)，且靈敏度高、穩(wěn)定性好。

3 石墨烯修飾電極

石墨烯具有表面積大、導(dǎo)電性好、易于功能化和修飾等特點(diǎn)，有利于負(fù)載尺寸小、分散度高的納米顆粒。石墨烯還可分為單層、雙層、多層等。

鄭龍珍，李引弟等人[8]取制備好的0.5 g/L GR-PDA仿生材料與2 g/L HRP混合超聲。再將5μL的HRP/GR-PDA、HRP/GO、HRP溶液滴加到拋光后的電極表面，于4℃冰箱干燥，再將5μL 0.1% Nafion溶液滴到電極制得新型生物傳感器。

夏前芳等人[9]用混合納米材料合成的高分子導(dǎo)電復(fù)合膜用EDC/NHS將HRP與其結(jié)合制備成生物傳感器。用循環(huán)伏安法進(jìn)行電化學(xué)機(jī)制的研究。

李業(yè)梅等[8]先制備了MC和DMF的混合液，再將混合液與HRP溶液混合，將混合液均勻涂抹在拋光后的電極，制備HRP-MC/EPC修飾電極。用循環(huán)伏安法將HRP-MC/EPC置于pH值 7.0的緩沖溶液中，研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用包埋法制備的修飾電極能讓HRP與電極之間進(jìn)行很好的電子傳遞，利用循環(huán)伏安的方法研究此修飾電極，該電極能對(duì)過(guò)氧化氫表現(xiàn)出良好的電催化性能，并且電極的穩(wěn)定性良好，能夠作為很好的生物傳感器。

李盼，閏麗君等[11]將離子液體、納米鈀-石墨烯(Pd-GR)復(fù)合材料、HRP、Nation分別滴加在碳糊電極(CILE)上，制備了全修飾電極Nation/HRP/Pd-GR/CILE。結(jié)果表明HRP與電極之間實(shí)現(xiàn)了直接的電子轉(zhuǎn)移。

4 納米二氧化鈦修飾電極

石巧翠，王素芬[12]通過(guò)將復(fù)合納米材料(CNT-TiO2)滴加在活化后的金電極表面，然后將HRP固定在其表面，制成了電化學(xué)生物傳感器HRP/CNT-TiO2/Au。之后采用循環(huán)伏安法5×10-5mol/L H2O2溶液掃描速度為0.05V/s的電化學(xué)工作站測(cè)其循環(huán)伏安曲線(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)納米二氧化鈦顆粒具有大的比表面積以及二氧化鈦與HRP之間的靜電吸附作用增大了HRP在CNT-TiO2/Au修飾電極表面的吸附量。另因碳納米管中單電子的存在使其成為性能優(yōu)良的電導(dǎo)體，因此碳納米管的存在能有效地促進(jìn)HRP與金電極表面之間的電子傳遞，使HRP能有效快速的催化氧化過(guò)氧化氫。

朱亞琦，武海等[13]把TiO2微粒和TiO2納米管分別與HRP修飾的GC進(jìn)行了電子轉(zhuǎn)移的比較。結(jié)果表明，TiO2納米管比TiO2微粒能更好的實(shí)現(xiàn)HRP的直接電化學(xué)。

5 聚合物膜修飾電極

李春香等人[15]取制備好的PME電極，在電極表面各滴加EDC和NHS 2μ L，清洗晾干后置于2mg/mL的HRP溶液中浸泡24h制得PHME。測(cè)定PHME在不同底液中的循環(huán)伏安圖與PME在不同底物的循環(huán)伏安圖，加入H2O2后，PHME的還原峰增加，表明此全修飾電極對(duì)H2O2有響應(yīng)，還可說(shuō)明該膜可作為介體膜傳遞電子，也表明聚合膜、HRP均能催化還原H2O2。

陳丹丹，劉寶紅，孔繼烈[16]將硫堇、HRP分別與Al2O3溶膠混合均勻，依次滴加在玻碳電極表面制備成過(guò)氧化氫生物傳感器。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：溶膠凝膠對(duì)酶的官能團(tuán)、鍵合方式等結(jié)構(gòu)均未發(fā)生變化。其還有固定酶的作用，而且對(duì)酶的活性損傷極小。

楊明輝等人[17]以玻碳電極將電聚合2，6-2吡啶二甲酸(PDC)，再通過(guò)靜電吸附自組裝一層聚陽(yáng)離子聚丙烯胺(PAH)，用于靜電吸附固定辣根過(guò)氧化物酶并以此方法固定多層酶膜制備過(guò)氧化氫傳感器。最后采用循環(huán)伏安法使修飾電極在含10-3mol/L對(duì)苯二酚1/15mol/L(pH值8.0)磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試。結(jié)果表明在加入6×10-3mol/L H2O2時(shí)其氧化峰明顯減小而還原峰急劇增大呈現(xiàn)典型的催化電流曲線(xiàn)表明催化電流主要是由H2O2在HRP的催化下氧化對(duì)苯二酚所產(chǎn)生的，其產(chǎn)物對(duì)苯醌在電極表面又還原為對(duì)苯二酚表明對(duì)苯二酚能有效地在玻碳電極及辣根過(guò)氧化物酶之間傳輸電子。通過(guò)靜電自組裝得到的有機(jī)超薄膜層是一種選擇性透過(guò)膜，能有效減少多種干擾物質(zhì)的干擾，有很好的抗干擾性。

馬美萍，曹建明，連國(guó)軍[18]將處理過(guò)得金電極避光浸泡在0.02mol/L 已除氧L-Cys的乙酸緩沖溶液中自組裝24h，得到了L-Cys修飾的金電極。再將電極放入HRP溶液中浸泡2h，再置于納米銀溶液中浸泡12h，用水沖洗曬干最后置于HRP溶液中浸泡2h，制得HRP/nano-Ag/HRP/L-Cys/Au電極。結(jié)果表明：該電極對(duì)H2O2的電催化作用主要是HRP引起的并且具有很好的電催化作用。

表1 HRP直接電化學(xué)不同修飾方法的參數(shù)值比較

6 展望

隨著現(xiàn)階段對(duì)生物傳感器的研究更加深入，構(gòu)建生物傳感器材料的優(yōu)化變得越來(lái)越重要，電化學(xué)檢測(cè)將更加簡(jiǎn)單、快速、便宜，在不久的將來(lái)，將會(huì)為人類(lèi)創(chuàng)造出更多的福利。

致謝: 感謝河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院對(duì)本項(xiàng)目以及參加全國(guó)大學(xué)生生命科學(xué)聯(lián)賽的大力支持。感謝河南省自然科學(xué)基金(182300410217),河南大學(xué)科學(xué)基金(Y1425013)和有毒有害氣體監(jiān)測(cè)系統(tǒng)項(xiàng)目(FX2222F08712)的資助。