南極磷蝦油中砷甜菜堿在大鼠體內(nèi)的代謝*

邱阿敏 劉小芳 唐一新 王曉濱 張輝珍 冷凱良

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2.青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 青島 266021；3.青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院 青島 266071)

南極磷蝦(Euphausia superba)是一種生活在南極海域的小型海洋浮游甲殼類動(dòng)物，現(xiàn)已成為世界遠(yuǎn)洋捕撈業(yè)最重要的漁業(yè)資源(劉勤等, 2014、2015)。南極磷蝦油以南極磷蝦為原料經(jīng)提取精制而得，因其富含ω-3 (EPA、DHA)系列多不飽和脂肪酸、磷脂以及蝦青素等功能脂類(Luet al, 2014； 劉建君等, 2014；聶玉晨等, 2016)，具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、改善腦細(xì)胞功能等多種生理活性(Heet al, 2013； Wanget al,2011； Zhouet al, 2016)而受到廣泛關(guān)注。2013年我國(guó)衛(wèi)生計(jì)生委第16號(hào)公告已批準(zhǔn)南極磷蝦油為新食品原料，但由于南極磷蝦油中具有較高的總砷含量，使人們對(duì)其食用安全性產(chǎn)生一定疑慮，同時(shí)也限制了其在食品、功能食品和醫(yī)藥制品領(lǐng)域的應(yīng)用推廣。

受原料及加工工藝影響，南極磷蝦油中總砷含量約為2.5～8.0 mg/kg，研究表明，其中主要砷形態(tài)是無(wú)毒的砷甜菜堿，含量為87.9%，而毒性較高的AsⅢ及AsⅤ僅約占南極磷蝦油中總砷含量的0.27% (王松等,2016)。本研究以南極磷蝦油中砷的主要形態(tài)—砷甜菜堿為重點(diǎn)研究對(duì)象，觀察灌胃添加高劑量砷甜菜堿的磷蝦油之后，大鼠臟器中總砷的吸收、蓄積、排泄及長(zhǎng)期灌胃后的蓄積情況，為科學(xué)解釋南極磷蝦油中砷的毒性提供數(shù)據(jù)支持，同時(shí)也為南極磷蝦油在食品、功能食品和醫(yī)藥制品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

砷甜菜堿：含量≥95%，購(gòu)于日本W(wǎng)ako公司，貨號(hào)：321-34911

南極磷蝦油：紅棕色透明油狀，貯存于干燥、密封處，總砷含量為3.92 mg/kg

大豆油：金龍魚(yú)大豆油，嘉里糧油(天津)有限公司，總砷含量為0.037 mg/kg

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體重180～220 g，購(gòu)于青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(魯)20140001。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25℃，濕度40%～70%，基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由飲食、飲水。

1.3 主要試劑與儀器

砷標(biāo)準(zhǔn)品：1000 μg/ml，GBW08611-15031(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心) 7500CX型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS，美國(guó)Agilent公司)，MARS EXPRESS微波消解儀(美國(guó)CEM公司)，BSA 224S-CW型分析天平(德國(guó) SartoriUS公司)，Milli-Q 超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore 公司)。

1.4 方法

1.4.1 24 h吸收代謝實(shí)驗(yàn) SPF級(jí)雄性Wistar大鼠54只，隨機(jī)分為3組：大豆油對(duì)照組(對(duì)照組)、磷蝦油組、添加100 mg/kg砷甜菜堿的磷蝦油組(砷甜菜堿磷蝦油組)，每組18只。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，灌胃劑量2.625 g油/kg·bw，于灌胃后1、2、4、6、12、24 h經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血處死大鼠，收集血漿，剝離肝臟、腎臟、脾臟，收集12 h及24 h尿液。血漿、臟器和尿液均貯存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 7 d、30 d連續(xù)灌胃實(shí)驗(yàn) SPF級(jí)雄性Wistar大鼠45只，隨機(jī)將動(dòng)物分為3組：對(duì)照組、磷蝦油組、砷甜菜堿磷蝦油組，每組5只。連續(xù)灌胃7 d，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，灌胃劑量2.625 g油/kg·bw，于末次灌胃后24 h，經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉，剝離肝臟、腎臟。相同的分組，每組10只，連續(xù)灌胃同等劑量的油脂30 d，末次灌胃后24 h，經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血處死大鼠，剝離肝臟、腎臟，貯存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 總砷的測(cè)定

血漿、臟器及尿液中總砷含量檢測(cè)分析按GB5009.11-2014標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定執(zhí)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

南極磷蝦油具有相對(duì)較高的總砷含量，但其所含的砷化合物絕大部分為砷甜菜堿，約占總砷含量的87.9% (王松等, 2016)。所以本研究采用總砷含量表征砷甜菜堿的代謝。

2.1 南極磷蝦油中砷甜菜堿24 h消化吸收代謝

2.1.1 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿中總砷含量變化 不同實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿中總砷含量變化情況如圖1所示。灌胃后，磷蝦油組和砷甜菜堿磷蝦油組血漿中總砷在1 h時(shí)含量最高，隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低。各時(shí)間節(jié)點(diǎn)下，砷甜菜堿磷蝦油組總砷含量高于對(duì)照組，但隨著代謝的進(jìn)行，大鼠血漿中總砷含量逐漸降低，24 h降至最高值的30%以下。磷蝦油組較對(duì)照組血漿總砷含量略有升高，但在24 h之內(nèi)即降低至正常水平。

圖1 不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)大鼠血漿中總砷含量Fig.1 Total arsenic content in rat plasma at different time points

2.1.2 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肝臟中總砷含量變化 不同實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟中總砷含量變化情況見(jiàn)圖2。灌胃后，砷甜菜堿磷蝦油組大鼠肝臟中總砷含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，于6 h達(dá)到最高，最高含量為6.24 mg/kg，而后逐漸降低，24 h含量降至最高值25%以下，趨近于初始水平。與對(duì)照組相比，磷蝦油組大鼠肝臟總砷含量除1 h時(shí)間節(jié)點(diǎn)外，均無(wú)顯著差異，且無(wú)隨時(shí)間變化的趨勢(shì)。

圖2 不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)大鼠肝臟總砷含量Fig.2 Total arsenic content in liver of rat at different time

2.1.3 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腎臟中總砷含量變化 不同實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟中總砷含量變化情況見(jiàn)圖3。灌胃后，砷甜菜堿磷蝦油組大鼠腎臟中總砷含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，于6 h達(dá)到最高，最高含量為2.97 mg/kg，而后逐漸降低，24 h含量降至最高值16%以下，恢復(fù)至初始水平。磷蝦油組相比于對(duì)照組，總砷含量沒(méi)有顯著性差異，且無(wú)隨時(shí)間變化的趨勢(shì)。

2.1.4 大鼠尿液中總砷含量變化 不同實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃12 h和24 h后尿液中總砷含量如表1所示。砷甜菜堿磷蝦油組和磷蝦油組大鼠12 h和24 h尿液中總砷含量明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。根據(jù)灌胃劑量2.625 g磷蝦油/kg·bw折算成砷甜菜堿含量，砷甜菜堿磷蝦油組每只大鼠平均分別給予0.0525 mg砷甜菜堿，磷蝦油組每只大鼠平均分別給予 0.00525 mg砷甜菜堿。根據(jù)12 h和24 h尿液量及總砷含量，計(jì)算得出砷甜菜堿的尿液排泄率。在 24 h之內(nèi)，磷蝦油組中的砷 85%隨尿液排出體外；砷甜菜堿磷蝦油組12 h尿液排泄率為36%，24 h尿液排泄率為80%。

圖3 不同時(shí)間的大鼠腎臟中總砷含量Fig.3 Total arsenic content in kidney of rat at different time

圖4 不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的大鼠脾臟中的總砷含量Fig.4 Total arsenic content in spleen of rat at different time

表1 大鼠尿液總砷含量±s, n=5)Tab.1 Total arsenic contents in the urine of the experimental rats ±s, n=5)

表1 大鼠尿液總砷含量±s, n=5)Tab.1 Total arsenic contents in the urine of the experimental rats ±s, n=5)

注：不同字母標(biāo)識(shí)代表各時(shí)間節(jié)點(diǎn)下不同實(shí)驗(yàn)組間具有顯著差異(P＜0.05)；— 表示無(wú)統(tǒng)計(jì)Note：Different letters represent significant differences between different experimental groups at each time point (P＜0.05)；—, no statistical calculation

組別Groups 12 h 24 h 12 h 24 h總砷含量 Total As (mg/kg) 尿液排泄率Urine excretion rate (%)對(duì)照組Control 0.073±0.007a 0.075±0.009a — —磷蝦油組 Krill oil group 0.418±0.079b 0.478±0.058b 42 85砷甜菜堿磷蝦油組Krill oil with arsenobetaine 3.756±0.486c 4.527±0.636c 36 80

2.1.5 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠脾中總砷含量變化 不同實(shí)驗(yàn)組大鼠脾中總砷含量變化情況如圖4所示。灌胃后，砷甜菜堿磷蝦油組脾中總砷含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增高，于6 h達(dá)到最高，最高含量為1.23 mg/kg，而后逐漸降低，24 h含量降至最高值30%，趨近于初始水平。與對(duì)照組相比，磷蝦油組大鼠脾臟總砷含量除 2 h和24 h時(shí)間點(diǎn)外均無(wú)顯著差異，且無(wú)隨時(shí)間變化的趨勢(shì)。

2.2 南極磷蝦油中砷甜菜堿7 d、30 d連續(xù)喂養(yǎng)

連續(xù)灌胃7 d和30 d后，不同實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟和腎臟中總砷含量見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，連續(xù)灌胃7 d和30 d，磷蝦油組和砷甜菜堿磷蝦油組大鼠肝臟和腎臟中總砷含量均無(wú)顯著變化(P＞0.05)，且二者間也無(wú)顯著差異(P＞0.05)。由此可見(jiàn)，隨著給予砷甜菜堿時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠肝臟和腎臟中總砷含量并沒(méi)有隨之增加。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，磷蝦油中的砷甜菜堿在體內(nèi)并不會(huì)產(chǎn)生蓄積作用。

表2 7 d、30 d喂養(yǎng)大鼠臟器中總砷含量(±s)Tab.2 Total arsenic contents in the organs of the experimental rats fed for 7 or 30 days (±s)

表2 7 d、30 d喂養(yǎng)大鼠臟器中總砷含量(±s)Tab.2 Total arsenic contents in the organs of the experimental rats fed for 7 or 30 days (±s)

*表示n=5, **表示 n=10*：n=5； **：n=10

肝臟 Liver (mg/kg) 腎臟 Spleen (mg/kg)組別Groups 7 d* 30 d** 7 d* 30 d**對(duì)照組 Control 1.161±0.209 1.002±0.300 1.019±0.111 1.072±0.381磷蝦油組 Krill oil group 1.270±0.123 1.378±0.308 1.183± 0.157 1.193±0.206砷甜菜堿磷蝦油組 Krill oil with arsenobetaine 1.891±0.390 1.731±0.158 1.565±0.277 1.439±0.445

3 討論

砷為有毒有害元素，砷毒性很大程度上取決于它的化學(xué)形態(tài)和氧化態(tài)(Nearinget al, 2014)，無(wú)機(jī)砷的毒性遠(yuǎn)大于有機(jī)砷(Khairulet al, 2017； Sadeeet al,2015)，有機(jī)砷中砷甜菜堿和砷膽堿被認(rèn)為是沒(méi)有毒性的。海產(chǎn)品中雖然砷含量較高，但多數(shù)是以有機(jī)砷的形態(tài)存在(Tayloret al, 2016)，且絕大部分為砷甜菜堿(Molinet al, 2015)。GB2762-2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》規(guī)定水產(chǎn)動(dòng)物及其制品無(wú)機(jī)砷限量為 0.5 mg/kg，南極磷蝦油符合這一標(biāo)準(zhǔn)要求。GB16740-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 保健食品》規(guī)定液態(tài)產(chǎn)品總砷限量為 0.3 mg/kg。南極磷蝦油相對(duì)較高的總砷含量使其在保健品領(lǐng)域的應(yīng)用受到了限制，因此，本研究針對(duì)攝食磷蝦油及其砷甜菜堿后大鼠血漿及臟器中總砷的代謝和蓄積情況進(jìn)行了考察。

本研究為考察南極磷蝦油中砷的安全性，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)將中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)膳食指南中規(guī)定的成人每日攝入 25 g油脂均更換為南極磷蝦油，考察最大限度攝入南極磷蝦油時(shí)，其所含的砷是否會(huì)帶來(lái)安全風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)成人和大鼠之間的劑量換算系數(shù)，計(jì)算得到大鼠灌胃劑量為2.625 g/kg·bw。肝臟是動(dòng)物和人體最重要的代謝器官，并且砷代謝主要在肝臟中進(jìn)行(劉洋等,2009)，而腎臟則是砷排泄的主要器官(李偉等, 2016)，脾是機(jī)體最重要的免疫和造血器官，研究證實(shí)砷暴露人群免疫功能受損(周勇等, 2010)。因此，本研究著重觀察了肝臟、腎臟和脾中砷甜菜堿的代謝情況。24 h消化吸收代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，灌胃南極磷蝦油后，大鼠血漿中總砷含量在1 h達(dá)到最高，而后逐漸降低，24 h之內(nèi)可降低至對(duì)照組水平。各時(shí)間節(jié)點(diǎn)下，磷蝦油組大鼠血漿、肝臟、腎臟中總砷含量較對(duì)照組均無(wú)顯著變化，脾中總砷含量較對(duì)照組略有升高，這與楊瑞瑛等(2005)的研究結(jié)果一致。砷甜菜堿磷蝦油組大鼠肝臟、腎臟和脾中總砷含量均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，到6 h達(dá)到最高，之后逐漸降低，24 h后均下降至最高值的30%以下，提示大劑量的砷甜菜堿不會(huì)在肝、腎、脾等臟器中被蓄積。尿液中總砷分析結(jié)果顯示，南極磷蝦油中85%的砷會(huì)在24 h之內(nèi)隨尿液排出體外，而其余小部分砷會(huì)隨膽汁等其他途徑排出體外(Doppet al, 2010)。Kaise等(1992)報(bào)道指出，砷甜菜堿具有低毒、不代謝的特點(diǎn)。檢測(cè)人攝食砷甜菜堿后的尿液發(fā)現(xiàn)，尿液中無(wú)機(jī)砷、一甲基砷酸和二甲基砷酸的濃度沒(méi)有出現(xiàn)升高現(xiàn)象，同樣證實(shí)了砷甜菜堿不會(huì)在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為其他代謝產(chǎn)物(陳甫華等,1993)。

7 d和30 d連續(xù)灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，磷蝦油組和砷甜菜堿磷蝦油組大鼠肝臟和腎臟中總砷含量均無(wú)明顯差異，證明磷蝦油乃至超出正常磷蝦油中砷甜菜堿10倍的供試物并不會(huì)隨著攝入時(shí)間的增加而在臟器中產(chǎn)生積累。這與陳甫華等(1993)的研究結(jié)果一致。砷甜菜堿在人體沒(méi)有產(chǎn)生明顯毒副作用的靶器官，不在體內(nèi)產(chǎn)生蓄積作用。另外，分別連續(xù)灌胃7 d和30 d，各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟和腎臟中總砷含量并未隨攝食時(shí)間的延長(zhǎng)而出現(xiàn)顯著變化，表明短期和長(zhǎng)期服用南極磷蝦油，其所含有的砷甜菜堿不會(huì)出現(xiàn)代謝蓄積現(xiàn)象。

綜上所述，攝食南極磷蝦油后，85%的砷會(huì)于24 h內(nèi)隨尿液排出體外，而短期及長(zhǎng)期攝食南極磷蝦油，體內(nèi)也不會(huì)產(chǎn)生砷蓄積現(xiàn)象。本研究系統(tǒng)解釋了南極磷蝦油中所含的砷在大鼠體內(nèi)的消化吸收代謝和蓄積情況，對(duì)于指導(dǎo)南極磷蝦油及其相關(guān)產(chǎn)品的科學(xué)消費(fèi)和拓展應(yīng)用具有重要意義。