一株感染深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖許氏平鲉的病原菌分離與鑒定*

王 凱 王印庚 姜 勇 張 正① 于永翔 廖梅杰

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院上海 201306；4.青島國家海洋科學(xué)研究中心 青島 266071)

許氏平鲉(Sebastes schlegeli)屬鲉形目(Scorpaeniformes)、鲉科(Scorpaenidae)、平鲉屬(Sebastes)，又稱“黑鲪”、“黑石鱸”、“黑頭”，在我國主要分布于黃渤海區(qū)域。因其肉質(zhì)鮮美，生長速度快，耐低溫，可在我國北方海域自然越冬，成為北方海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要魚類品種之一(常青等, 2009；顧中華等, 2015)。山東省長島縣大欽島周邊是我國北方大型深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的最大集中地，養(yǎng)殖的主要品種就是許氏平鲉。經(jīng)過20年余的發(fā)展，隨著該海區(qū)深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，疾病的發(fā)生也越來越頻繁，成為影響?zhàn)B殖成活率的關(guān)鍵因素。特別是近幾年來，該海區(qū)養(yǎng)殖的許氏平鲉疾病呈現(xiàn)了傳染速度快、死亡率高等突出特點，已經(jīng)嚴(yán)重影響了正常的養(yǎng)殖生產(chǎn)。

2016年 7～9月，大欽島周邊海域深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的許氏平鲉再次發(fā)生大規(guī)模的疾病，引發(fā)了較為嚴(yán)重的死亡現(xiàn)象。病魚的主要臨床癥狀表現(xiàn)為：表皮出現(xiàn)明顯創(chuàng)傷性潰瘍，鰭條潰爛，個別病魚眼球突出、潰爛。本研究通過現(xiàn)場采集發(fā)病魚樣品，對病魚體表病灶和腸道、肝臟、腎臟等內(nèi)臟器官進行了病原菌分離，通過人工感染實驗驗證其致病性，并對病原菌的形態(tài)特征、生化特性、分類地位及藥物敏感性等進行了分析，以期為防控該病提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用病魚取自山東省長島縣大欽島周邊深水網(wǎng)箱，具有典型的皮膚潰瘍等臨床癥狀。人工感染用魚購自威海某育苗場，體重(37.1±5.0) g。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原菌分離純化與形態(tài)觀察 現(xiàn)場采集具有典型癥狀的病魚帶回實驗室進行病原學(xué)檢驗。解剖前，取病魚的黏液、病灶、鰓等組織制成水浸片，觀察是否有明顯寄生蟲及霉菌。無菌解剖后取病灶、腸、肝、腎等組織用 2.5%戊二醛固定液處理，透射電鏡觀察是否有病毒侵染。取病灶、腸、肝、腎等組織用1.5%滅菌生理鹽水人工勻漿，適當(dāng)稀釋后分別涂布于TSB和TCBS瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)觀察，觀察優(yōu)勢菌情況并進行分離、純化培養(yǎng)，純化后的菌株用20%甘油生理鹽水保存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 人工感染實驗 將分離純化的優(yōu)勢菌接種于TSB瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h，用1.5%滅菌生理鹽水沖洗菌苔，經(jīng)分光光度法和平板計數(shù)法測定其菌懸液濃度為5.2× 109CFU/ml。用生理鹽水對該菌懸液進行梯度稀釋后分別制成 5.2×108、5.2×107、5.2×106、5.2×105CFU/ml的菌懸液用于感染試驗的注射菌液。取健康許氏平鲉140尾，分為7組，即5個實驗組、1個陰性對照組和 1個空白對照組，每組20尾。實驗組從背部肌肉注射(王曉冉等, 2017) 0.1 ml的菌液，陰性對照組注射等量的1.5%滅菌生理鹽水，空白對照組不做處理。飼養(yǎng)條件為160 L塑料桶，水溫控制在17～19℃。注射后觀察記錄魚的癥狀和發(fā)病死亡情況，對病魚及時進行病原菌分離和鑒定。

1.2.3 病原菌理化特性研究 將病原菌接種于TSB和TCBS瓊脂培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)和大小。對細菌進行革蘭氏染色觀察，同時，用 2.5%戊二醛固定液處理，透射電鏡下觀察細菌形態(tài)。在無菌條件下挑取單一純菌落制備菌懸液，用常規(guī)的生理生化試劑盒(青島海博生物技術(shù)有限公司)對病原菌進行理化特性測定。

1.2.4 菌株gyrB和16S rDNA基因序列測定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析 挑取單菌落于50 μl去離子水中反復(fù)吹打，99℃金屬浴 10 min，12000 r/min 離心 1～2 min，取上清液作PCR模板。gyrB基因序列的PCR擴增引物為 UP-1 (正向引物)：5'-GAAGTC ATCATGACCGTTCTGCA(C/T)GCAGGAGGCAA(A/G)TTCGA-3'和UP-2r (反向引物)：5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCATCGAC (A/G)TCGGCGTCCGTCAT-3'。16S rDNA基因序列的PCR 擴增引物為27F (正向引物)：5'-AGA GTT TGA TC(C/A) TGG CTC AG-3'和1492R(反向引物)：5'-RGGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。PCR 反應(yīng)體系 50 μl，包括 2 μl DNA 模板，5 μl 10×PCR Buffer，4 μl dNTP (2.5 mmol/L)，0.5 μlTaqDNA酶(5 U/μl)，正反向引物各 0.8 μl (10 μmol/L)，用滅菌雙蒸水補足至50 μl。擴增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min 20 s，30 個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳純化，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收產(chǎn)物。

取回收的產(chǎn)物用pMD18-T載體連接，混勻后加入SolutionI，16℃金屬浴中連接6 h以上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞 DH-5α中，挑選有插入目的片段的陽性克隆送上海生工生物工程股份有限公司測序。將gyrB和16S rDNA基因序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進行序列同源性分析，從中分別選取與所獲的序列同源性較高的菌株的gyrB和16S rDNA基因序列，用 Mega 6.0采用鄰接法(Neighbor-joining method)獲得系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過 Bootstrap法(1000次重復(fù))檢驗。

1.2.5 藥物敏感性實驗

采用紙片擴散法對菌株進行藥物敏感性測試?？咕埰捎煤贾萏旌臀⑸镌噭┕镜乃幟艏埰噭┖?，將抗菌紙片貼于涂滿菌液的 MH瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)18～24 h后，參考陳建國等(2017)記錄菌株對抗菌藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 病魚檢查

患病許氏平鲉初期攝食下降，貼于網(wǎng)箱壁緩慢游動，中后期軀體表面出現(xiàn)創(chuàng)傷潰瘍，鰭條略有潰爛。解剖病魚發(fā)現(xiàn)腸壁透明，有少量積水，肝臟質(zhì)地松散，顏色較淺。黏液、病灶和鰓等器官組織水浸片檢查未見寄生蟲和真菌，光學(xué)顯微鏡下觀察無寄生蟲和真菌；透射電鏡觀察病灶、腸、肝、腎等組織無病毒粒子出現(xiàn)(圖1)。

圖1 患病許氏平鲉體表潰瘍Fig.1 The diseased S.schlegeli with skin ulcer

2.2 病原菌的形態(tài)觀察

從病魚病灶中分離出一株具有絕對優(yōu)勢的菌株，命名為BZ01。對BZ01進行分離純化培養(yǎng)，在TSB瓊脂平板培養(yǎng)18～24 h后菌落呈半透明圓形，表面光滑，中央略隆起，直徑多在2 mm左右(圖2A)，同時菌落有明顯臭味。在TCBS上該菌也可生長，菌落圓形光滑、邊緣整齊、隆起、呈綠色(圖2B)。革蘭氏染色呈陰性，短棒狀(圖2C)。透射電鏡觀察, 菌株呈短桿狀、兩端鈍圓, 具單根極生鞭毛, 菌體大小約為1.8 μm×0.8 μm (圖 2D)。

圖2 菌株的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of the strain

2.3 致病性驗證

感染試驗共進行12 d，以注射結(jié)束后24 h計為1 d，以此類推。如圖 3 所示，5.2 × 109、5.2 × 108、5.2 × 107、5.2 × 106CFU/ml實驗組的許氏平鲉均在注射菌液2 d后出現(xiàn)死亡。其中，5.2 × 109CFU/ml組在第3天全部死亡，5.2×108CFU/ml組在第5天全部死亡，5.2×107CFU/ml組在第7天全部死亡。低濃度組(5.2×105CFU/ml組)在第5天開始出現(xiàn)死亡，實驗結(jié)束時累計死亡率為65%。陰性對照組和空白對照組均無死亡。人工感染后實驗魚攝食量減少，貼于桶壁緩慢游動、活力下降，注射處出現(xiàn)紅腫，皮膚出現(xiàn)點狀潰瘍、出血，后期潰瘍創(chuàng)面逐漸擴大，部分病魚會出現(xiàn)腹水和白便現(xiàn)象，與自然感染下癥狀一致，而陰性對照組和空白對照組未出現(xiàn)任何異狀。參考李長紅等(2009)的改良寇氏法，計算出菌株 BZ01對許氏平鲉12 d 的 LD50為 2.07×106CFU/ml。

圖3 菌株BZ01人工感染實驗結(jié)果Fig.3 The artificial infection results of the strain BZ01

2.4 病原菌理化特性和藥物敏感性測定

菌株BZ01的理化特性結(jié)果見表1?？衫闷咸烟?、甘露醇和阿拉伯糖，不利用蔗糖和乳糖，氧化酶陽性，鳥氨酸水解酶和賴氨酸水解酶陽性，精氨酸雙水解酶陰性，其理化特性與輪蟲弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株LMG21460T僅在密二糖和西蒙氏枸椽酸鹽 2個指標(biāo)上有差異。

2.5 病原菌gyrB和16S rDNA基因序列測定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

由引物UP-1和UP-2r擴增菌株BZ01的gyrB基因序列，獲得有效基因序列長度為1141 bp，通過Blast檢索發(fā)現(xiàn)其與弧菌屬同源性較高。其中，與輪蟲弧菌(Vibrio rotiferianus)同源性達99%。從NCBI數(shù)據(jù)庫中調(diào)取相似度最高的10個菌株的gyrB基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4所示，菌株BZ01與輪蟲弧菌聚合，置信度為100%。

表1 菌株BZ01的生理生化特征Tab.1 The biochemical reaction of the strain BZ01

由引物27F和1492R擴增菌株BZ01的16S rDNA基因序列，獲得有效基因序列長度為1480 bp，通過Blast檢索發(fā)現(xiàn)其與弧菌屬序列同源性最高。其中，與輪蟲弧菌(Vibrio rotiferianus)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、坎氏弧菌(Vibrio campbellii)及需鈉弧菌(Vibrio natriegens)序列均有較高相似度。從以上相似度最高的序列中選擇12個菌株的16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖5所示，菌株BZ01與輪蟲弧菌聚合，置信度為51%。

綜合gyrB和16S rDNA基因序列鑒定結(jié)果，將菌株BZ01鑒定為輪蟲弧菌。

2.6 藥敏實驗

對菌株BZ01進行30種抗菌藥物的敏感性實驗，結(jié)果顯示，該菌株對菌必治、新霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、氟哌酸、氟羅沙星、新生霉素、強力霉素、萘啶酸和氟苯尼考10種藥物高度敏感，對美滿霉素和頭孢噻肟 2種藥物中度敏感，而對青霉素、吡哌酸、頭孢他啶、鏈霉素、頭孢氨芐、頭孢拉定、先鋒必、頭孢唑啉、乙酰螺旋霉素、克拉霉素、阿米卡星、慶大霉素、阿奇霉素、卡那霉素、苯唑青霉素、氨芐青霉素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明18種藥物耐藥。

圖4 基于gyrB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree based on gyrB gene sequence alignment

圖5 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence alignment

3 討論

山東省長島縣作為中國北方最大的深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地，在冷水性魚類尤其是許氏平鲉的網(wǎng)箱養(yǎng)殖中占有極其重要的地位。但近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，加之當(dāng)?shù)貪O民傳統(tǒng)作業(yè)生產(chǎn)中大量使用冰鮮雜魚餌料，致使水中有害微生物逐漸增多，疾病頻繁暴發(fā)，給當(dāng)?shù)貪O業(yè)發(fā)展造成巨大的經(jīng)濟損失。其中，細菌性疾病更以其高傳染率和死亡率成為限制行業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素。目前，已報道的可對許氏平鲉致病的細菌主要有β-溶血性鏈球菌(β-heamolytic streptococcus)(Masahiroet al, 1986)格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)(Kanget al, 2004)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida) (Hanet al, 2011)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi) (孟鵬等, 2010； Wonet al, 2008)、海分枝桿菌(Mycobacterium marinum) (繩秀珍等, 2011)、鰻利斯頓氏菌(Listonella anguillarum) (王庚申等, 2012)等。

本研究從患有皮膚潰瘍癥的許氏平鲉體表病灶分離到一株絕對優(yōu)勢菌，通過回歸感染試驗，驗證該菌對許氏平鲉具有較強的致病力，人工感染后的許氏平鲉表現(xiàn)出體表潰瘍等與自然感染相同的癥狀。經(jīng)細菌形態(tài)特征、生理生化、gyrB和16S rDNA基因序列比對分析等多種方法將該菌株鑒定為輪蟲弧菌。國外有關(guān)輪蟲弧菌的報道始見于 2003年，由 Gomez-Gil等(2003)在褶皺臂尾輪蟲中分離得到，此后陸續(xù)出現(xiàn)有關(guān)于該菌的報道(Chowdhuryet al, 2011； Labbateet al, 2011)。近幾年來，國內(nèi)分別在養(yǎng)殖半滑舌鰨(陳政強等, 2012)、南美白對蝦(金春英, 2013)和線紋海馬(楊求華, 2017)中發(fā)現(xiàn)了輪蟲弧菌。感染該菌的半滑舌鰨主要癥狀為體表潰爛、尾部出血?；疾∧厦腊讓ξr主要癥狀為體表發(fā)紅、肌肉白濁、鰓部變黃潰爛。而患病線紋海馬主要癥狀為腹部凹陷，尾部呈L形，尾末端表皮脫落、潰爛等。但輪蟲弧菌感染游泳性魚類發(fā)病的案例尚未見報道。值得一提的是，本研究得到的輪蟲弧菌在TCBS培養(yǎng)基上菌落為綠色，說明其不發(fā)酵蔗糖，因此，不能采用TCBS培養(yǎng)基對其進行定性鑒定。從16S rDNA和gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹上看, 根據(jù)16S rDNA基因序列建立的發(fā)育樹置信度普遍較低, 菌株BZ01與輪蟲弧菌(NR04281.1)置信度為51%，遠低于gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度。因此，在區(qū)分親緣關(guān)系較近的種類時，gyrB基因序列更為適合做分類研究(王曉冉等, 2017)。

表2 菌株BZ01對抗菌藥物的敏感性測試Tab.2 The drug sensitivity test of strain BZ01

從藥敏實驗結(jié)果來看，此次分離的輪蟲弧菌對不同類抗菌藥物的敏感性不同。其中，對四環(huán)素類(四環(huán)素、強力霉素)、喹諾酮類(氧氟沙星、氟哌酸、氟羅沙星、萘啶酸)、香豆素類(新生霉素)、肽酰轉(zhuǎn)移酶類(氟苯尼考)高度敏感，而對大環(huán)內(nèi)酯類(克拉霉素、乙酰螺旋霉素、阿奇霉素)、多肽類(多粘菌素B)、磺胺類(復(fù)方新諾明)、β-內(nèi)酰胺類(青霉素、苯唑青霉素、氨芐青霉素、頭孢他啶、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢噻肟、先鋒必)、氨基糖苷類(鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星)中度敏感或不敏感。而在海馬中發(fā)現(xiàn)的輪蟲弧菌(楊求華等, 2017)對頭孢類和氨基糖苷類敏感，對四環(huán)素類和喹諾酮類耐藥，這與本次得到的輪蟲弧菌藥物敏感性不同，這說明同種細菌不同菌株也會因養(yǎng)殖環(huán)境不同而表現(xiàn)不同的耐藥性。因此，養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)當(dāng)合理篩選和使用抗菌藥物，既要達到理想的預(yù)防治療疾病效果，更要避免細菌耐藥性的產(chǎn)生。