青海高原耐旱蠶豆品種青海13號響應(yīng)干旱脅迫蛋白質(zhì)組學(xué)分析

李 萍 侯萬偉 劉玉皎,*

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青海高原耐旱蠶豆品種青海13號響應(yīng)干旱脅迫蛋白質(zhì)組學(xué)分析

李 萍1,2侯萬偉1,2劉玉皎1,2,*

1青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院, 青海西寧 810000;2青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青海西寧 810000

蛋白質(zhì)組學(xué)研究在功能基因組時代發(fā)揮著越來越重要的作用, 利用雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜鑒定技術(shù), 可大量研究作物逆境脅迫后蛋白質(zhì)組的變化, 增加作物響應(yīng)干旱脅迫機(jī)制的認(rèn)識和理解。為探討一種抗旱性蠶豆青海13號品種的耐旱機(jī)制, 本研究對其幼苗期進(jìn)行干旱脅迫處理, 應(yīng)用上述技術(shù)進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組分析, 經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)32個差異表達(dá)蛋白點(diǎn), 部分呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá), 部分呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá), 還有7個消失蛋白點(diǎn)和1個新增蛋白點(diǎn)。采用MALDI-TOF/TOF鑒定和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn), 成功鑒定的21個蛋白點(diǎn)按其所參與的代謝途徑和生化功能可分為七大類, 參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的2個, 參與自由基清除的1個, 參與防衛(wèi)反應(yīng)的1個, 參與代謝的8個, 參與蛋白加工的1個, 參與光合的5個, 未知功能蛋白3個。22 kD干旱誘導(dǎo)蛋白、應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白、17.5 kD一級熱激蛋白、超氧化物歧化酶是與抗旱性有直接關(guān)聯(lián)的蛋白點(diǎn), 其相對表達(dá)量的上調(diào)可能是青海13號蠶豆具有較強(qiáng)抗旱性的重要原因。

蠶豆; 干旱脅迫; 蛋白質(zhì)組; 差異表達(dá); 功能分類

干旱是脅迫因素中對植物的生長發(fā)育影響最大的因子之一, 而對農(nóng)作物造成的損更是嚴(yán)重[1], 在眾多非生物脅迫中占首位。有學(xué)者在關(guān)于植物的抗性研究中指出在水分脅迫下植物能夠產(chǎn)生一系列包括形態(tài)、生理生化及分子生物學(xué)等多方面的變化而表現(xiàn)出抗旱能力, 這些適應(yīng)性調(diào)節(jié)反應(yīng)是植物自身的保護(hù)性選擇[2-3]。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究生物體在特定時間或空間內(nèi)所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的特征, 是揭示植物與脅迫之間相互作用分子機(jī)制的一種新手段。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展和植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究的日趨深入, 以通過研究植物在非生物逆境脅迫過程中抗逆相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)而進(jìn)一步了解逆境脅迫的傷害機(jī)制及植物的逆境適應(yīng)機(jī)制的逆境蛋白質(zhì)組學(xué)研究成為熱點(diǎn)[4–6]。雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個重要支撐技術(shù), 結(jié)合質(zhì)譜技術(shù),仍是目前最常用和可靠的蛋白質(zhì)分離鑒定技術(shù)平臺, 涉及豆科作物逆境脅迫后蛋白質(zhì)組的變化, 屢有對獲得的差異蛋白進(jìn)行功能研究的報(bào)道。Mohammadi等[7]對干旱脅迫和PEG滲透脅迫處理的大豆幼苗研究發(fā)現(xiàn), 脅迫處理下葉片中代謝相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào), 能量和蛋白質(zhì)合成相關(guān)蛋白下調(diào)表達(dá), 葉片、根、下胚軸這3個器官中蛋氨酸合成酶的mRNA與蛋白水平均下調(diào), 蛋氨酸合成酶是一種干旱反應(yīng)蛋白, 其下調(diào)表達(dá)抑制了大豆幼苗的正常生長。蛋白質(zhì)組學(xué)在菜豆干旱脅迫[8]、冷脅迫[9]和紫花苜蓿[10]鹽脅迫、箭舌豌豆[11]化學(xué)脅迫等方面得以廣泛應(yīng)用, 為深入開展豆科作物抗逆蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了參考和借鑒。本課題組前期對水分脅迫下蠶豆葉片蛋白質(zhì)組變化初探發(fā)現(xiàn), 脅迫后的葉片差異蛋白中下調(diào)表達(dá)的占大多數(shù)且主要與脅迫防御、代謝和能量、細(xì)胞骨架以及氧化平衡有關(guān), 上調(diào)表達(dá)的相對較少, 主要參與蛋白折疊與聚集以及光合系統(tǒng)[12]。

蠶豆(L.)屬蝶形花科野豌豆屬, 是世界上重要的豆科作物, 也是青海高原重要的糧食、蔬菜、副食、飼料和養(yǎng)地兼有作物, 在該省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)和生態(tài)保護(hù)中占有重要的地位。本研究采用人工控水模擬干旱脅迫, 研究葉片蛋白質(zhì)水平的響應(yīng), 發(fā)掘與蠶豆抵御干旱脅迫相關(guān)蛋白, 為后續(xù)的抗旱基因克隆和抗逆分子育種工作提供有力技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

青海13號是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中表現(xiàn)強(qiáng)抗旱性的蠶豆品種, 由青海省農(nóng)林科學(xué)院提供。挑選色澤正常無病斑的種子, 經(jīng)10%次氯酸溶液消毒及蒸餾水漂洗, 置玻璃培養(yǎng)皿中25℃恒溫光照培養(yǎng)催芽, 24 h后挑選發(fā)芽一致的蠶豆種子種植在抗旱棚中, 播種4周后待蠶豆幼苗長至二葉一心時進(jìn)行不同梯度人工控水模擬干旱脅迫處理。第1天, 對第10排蠶豆(DS9)停止供水, 由其蒸騰作用開始進(jìn)行自然干旱; 第2天, 對第9排蠶豆(DS8)停止供水開始自然干旱; 以此類推, 直到第2排蠶豆(DS1)開始干旱脅迫, 以正常供水為對照(CK)。

1.2 IEF/SDS-PAGE雙向電泳技術(shù)及質(zhì)譜分析

參照改良后的TCA/丙酮法[13], 略有改進(jìn), 提取葉片總蛋白。第一向IEF采用17 cm, pH 3~10 (NL)固相膠條, 上樣量900 μg; 第二向采用12%的聚丙烯酰胺分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后以考馬斯亮藍(lán)染色經(jīng)UMAX Power look 2100 XL型光密度掃描儀掃描, 以300 dpi分辨率采集圖像。采用PD Quest 8.0.1軟件比較處理組和對照組的葉片總蛋白2-DE圖譜, 通過差異蛋白點(diǎn)檢測, 凝膠圖譜標(biāo)準(zhǔn)化處理, 蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配和生物統(tǒng)計(jì), 確定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn), 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次數(shù)據(jù)進(jìn)行-test檢驗(yàn), 倍數(shù)變化>2或<0.5為差異蛋白。挖取差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)送上海鹿明生物有限公司進(jìn)行MALDI- TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析, 采用ABI5800串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜點(diǎn)靶鑒定, 獲得的PMF的質(zhì)譜掃描范圍為800~3500 Da, 對選擇強(qiáng)度最大的10個峰進(jìn)行二級質(zhì)譜, 將一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)整合并使用GPS 3.6 (Applied Biosystems)和Mascot2.3(Matrix Science)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和蛋白鑒定。進(jìn)行NCBInr-Other green plants數(shù)據(jù)庫檢索, 消化多肽的酶為胰蛋白酶, 允許最大漏切位點(diǎn)為1, 固定修飾為Carbamidomethyl (C), 可變修飾為Acetyl (Protein N-term)、Deamidated (NQ)、Dioxidation (W)和Oxidation (M), MS tolerance為0.0001 Da, MS/MS tolerance為0.3 Da, Protein score C.I.%大于95%為鑒定成功。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫最適時期確定

土壤含水量(SWC)是表征干旱脅迫程度的一個重要的正相關(guān)指標(biāo)。通過圖1可以看出, SWC呈顯著下降趨勢, 從42.67% (SWCCK)下降到6.7% (SWCDS9),與對照相比各處理間差異極顯著, 說明本實(shí)驗(yàn)采用的不同干旱脅迫梯度設(shè)置成功, 從DS1到DS9干旱脅迫程度逐漸加強(qiáng)。其中, DS3的SWC下降迅速, 出現(xiàn)一個“折點(diǎn)”, 脅迫繼續(xù)增加, DS4和DS5與DS6至DS9脅迫間差異不顯著。由此可見, 可在后續(xù)蠶豆抗旱性研究中直接選擇DS3作為干旱脅迫的最適處理期。植物葉片相對含水量(RWC)是衡量植物持水能力強(qiáng)弱的重要指標(biāo), 在一定程度上體現(xiàn)植物抗旱能力。由圖1可以看出, 隨著脅迫時間的延長, 蠶豆葉片RWC呈下降趨勢, 但與正常供水對照相比, 直到干旱脅迫DS4時其RWC含量才與CK差異顯著。值得注意的是, 在干旱脅迫處理下, SWC在DS3處理期極顯著減小(<0.01)的情況下蠶豆葉片的RWC與對照相比在0.05水平上無顯著差異, 這也是實(shí)驗(yàn)材料青海13號具有抗旱性的一個生理表現(xiàn), 選擇此材料非常具有代表性。

圖1 不同梯度干旱脅迫下土壤含水量(SWC)和蠶豆葉片的相對含水量(RWC)變化

大寫字母表示不同脅迫處理間0.01水平上顯著性差異, 小寫字母表示0.05水平上差異顯著。DS1~DS9為不同梯度干旱脅迫處理, 從DS1到DS9干旱脅迫程度逐漸加強(qiáng)。

The letter denotes differences between stress degree: the same letters indicate significant difference at the 0.05 probability level; Capital letters indicate significant difference at the 0.01 probability level. DS1–DS9 are drought stress treatments and the drought stress degrees gradually strengthened from DS1 to DS9.

2.2 雙向電泳圖譜構(gòu)建和質(zhì)譜分析

DS3脅迫處理是適宜的脅迫條件, 故取此處理時期的蠶豆葉片進(jìn)行下一步分析。利用本課題組前期建立的改良后的TCA/丙酮法分別提取對照組和處理組葉片總蛋白進(jìn)行雙向電泳, 經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后獲得最終電泳圖譜(圖2)。

圖2 干旱脅迫下蠶豆葉片蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜

應(yīng)用PD Quest8.0.1軟件對凝膠圖譜進(jìn)行分析, 結(jié)合人工篩選,-檢測, 共有38個蛋白點(diǎn)的表達(dá)發(fā)生顯著變化(Fold＞2.0或<0.5,<0.05)。處理組相對于正常對照組有10 個差異蛋白點(diǎn)的相對表達(dá)量上調(diào),占總差異蛋白點(diǎn)的26.3%, 其中特異表達(dá)的差異蛋白1個(3809)。而28個差異蛋白點(diǎn)的相對表達(dá)量下調(diào), 占總差異蛋白點(diǎn)的73.7%, 其中消失的蛋白點(diǎn)7個。挖取蠶豆葉片2-DE凝膠對差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析, 通過MASCOT數(shù)據(jù)庫對獲得的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行搜索比對, Mowse Score大于65分的蛋白即為鑒定的蛋白。通過分析成功鑒定了38個差異蛋白點(diǎn)中的27個, 鑒定率為71.1%, 這些成功鑒定的蛋白點(diǎn)的具體信息列于表1。鑒定結(jié)果表明,有多個蛋白點(diǎn)被鑒定為一個相同蛋白, 如葉綠素/結(jié)合蛋白AB80 (gi|115788: 蛋白點(diǎn)2036和2309), ATP合酶CF1 (gi|528749836: 蛋白點(diǎn)3815和3816), 質(zhì)體轉(zhuǎn)酮醇酶(gi|357445031: 蛋白點(diǎn)5808和5809), 碳酸酐酶葉綠體X1 (gi|502090577: 蛋白點(diǎn)6303、7307和7311), 核酮糖-二磷酸羧化小鏈3C (gi|132097: 蛋白點(diǎn)7005和8004), 最后27個成功鑒定的蛋白代表了21個非冗余的蛋白質(zhì)。

2.3 差異蛋白的功能及生物信息學(xué)分析

根據(jù)鑒定出來的21個差異蛋白所參與的代謝途徑和生化功能將其分為7類(圖3)。(1)參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的2個蛋白, 占所有蛋白的10%, 分別為22 kD干旱誘導(dǎo)蛋白(drought inducible 22 kD protein, spot 2705)和應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白(stress-inducible protein, spot 5807)。(2)參與自由基清除的1個蛋白, 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, spot 3106)。(3)參與防衛(wèi)反應(yīng)的1個蛋白, 17.5 kD一級熱激蛋白(17.5 kD classⅠHSPza, partial, spot 3208)。(4)參與代謝的8個蛋白占到所有蛋白的38%, 屬于最大一類, 分別為莽草酸酯脫氫酶(Shikimate dehydrogenase substrate binding, N-terminal, partial (ISS), spot 3809)、乙酰絲氨酸裂解酶(0-acetylserin(thiol)lyase, spot 5605)、胰蛋白酶抑制劑(Kunitz-type trypsin inhibitor-like 2 protein, spot 7206)、1,4-前體D-麥芽糖水解酶(1,4-alpha- D-glucan maltohydrolase, spot 1815)、ATP合酶CF1 (ATP synthase CF1 alpha subunit, spot 3815)、S-腺苷甲硫氨酸合酶(S-adenosylmethionine synthase 2, spot 4707)、質(zhì)體轉(zhuǎn)酮醇酶(plastid transketolase, spot 5808)和脫鹵素酶水解酶(haloacid dehalogenase-like hydrolase domain-containing protein At3g48420, spot 1404)。(5)參與蛋白加工的1個蛋白, nascent肽-關(guān)聯(lián)復(fù)合體亞基蛋白I (nascent polypeptide-associated complex subunit alpha-like protein 1, spot 408)。(6)參與光合的5個蛋白, 分別是葉綠體/結(jié)合蛋白AB80 (chlorophyll/binding protein AB80, spot 2306)、葉綠體/結(jié)合蛋白8 (chlorophyll a/b binding protein 8, chloroplastic-like, spot 5314)、RuBisCO小亞基3C (Ribulose bisphosphate carboxylase small chain 3C, spot 7005)、碳酸酐酶、葉綠體同型X1 (carbonic anhydrase, chloroplastic isoform X1, spot 7307)和光合系統(tǒng)II修補(bǔ)蛋白PSB27-H1 (photosystem II repair protein PSB27-H1, spot 8010)。(7)未知功能蛋白3個, 假定蛋白TSUD-183880 (hypothetical protein TSUD_183880, spot 2813)、未知蛋白(gi|217071344, spot 5202)和未命名的蛋白(unnamed protein product, spot 7608)。

基于主流的數(shù)據(jù)庫David 6.7和QuickGO (http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/)將21個差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜搜庫檢索得到ID, 同源映射到模式植物擬南芥上進(jìn)行GO (gene ontology)富集差異表達(dá)蛋白生物信息學(xué)分析(圖4)。從圖中可以看出, 這21個差異蛋白在生物過程富集分析中參與了20個生物學(xué)過程, 主要參與光合系統(tǒng)、有機(jī)化合物代謝、有機(jī)物生物合成、響應(yīng)非生物刺激等生物過程; 在細(xì)胞定位富集中可以定位到類囊體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器部分、胞內(nèi)細(xì)胞器、核糖核蛋白復(fù)合物、外部包裝結(jié)構(gòu)、蛋白酶體核心復(fù)合物7個細(xì)胞中, 其中在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器部分及胞內(nèi)細(xì)胞器富集蛋白百分比均超過50%; 在分子功能富集分析中, 21個差異蛋白在未折疊蛋白、前蛋白、核苷磷酸、核苷酸、核苷、核糖核苷酸、同類蛋白、幾丁質(zhì)、熱休克蛋白等的結(jié)合及轉(zhuǎn)移酶活性、陰離子配位和異構(gòu)酶活性中發(fā)揮功能, 其中參與核苷磷酸結(jié)合和核苷酸結(jié)合的蛋白富集百分比均為38.2%, 參與核苷結(jié)合和核糖核苷酸結(jié)合的蛋白富集百分比均為31.1%, 而參與陰離子配位的蛋白富集百分比為34.6%。

3 討論

植物在遭受干旱等逆境脅迫后基因表達(dá)發(fā)生改變,表現(xiàn)出原來一些蛋白的合成受到抑制, 也會新合成一些蛋白[14-15], 它們是植物抗旱一系列生理生化反應(yīng)的基礎(chǔ), 因此分析脅迫前后蛋白組的變化對從蛋白質(zhì)水平了解植物的抗逆機(jī)制是很有幫助的[16-18]。比起蛋白的增加或新蛋白的出現(xiàn), 干旱更容易引起蛋白含量的減少或丟失[19], 本研究中雙向電泳分析結(jié)果也得出了相同的結(jié)論, 在分離到的38個差異蛋白點(diǎn)中, 下調(diào)表達(dá)蛋白數(shù)量高于上調(diào)表達(dá)蛋白, 其中消失的蛋白有7個(spot 1504、spot 5202、spot 5314、spot 5814、spot 7311、spot 7808、spot 8102),說明干旱脅迫抑制了蠶豆植物體某些蛋白的合成來提高對干旱環(huán)境的適應(yīng)性, 亦或提高一些蛋白的表達(dá)量(8個上調(diào)表達(dá)蛋白), 同時又誘導(dǎo)產(chǎn)生一些新的蛋白如莽草酸之脫氫酶(Shikimate dehydrogenase substrate binding, N-terminal, partial (ISS), spot 3809), 從而提高蠶豆植株對干旱的耐受能力。利用MALDI-TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)成功鑒定了21個非冗余的干旱響應(yīng)相關(guān)差異蛋白, 涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、防衛(wèi)反應(yīng)、光合作用、能量代謝、自由基清除、蛋白加工等過程, 還有部分獲得的蛋白為未知功能蛋白。

圖4 差異蛋白GO功能分類

本研究中參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Drought inducible 22 kD protein (spot 2705)和stress-inducible protein (spot 5807)等蛋白表達(dá)豐度均上調(diào), 推測蛋白酶體的增加有利于清除在干旱脅迫條件下產(chǎn)生的非正常蛋白。Desclos等[20]發(fā)現(xiàn)油菜干旱誘導(dǎo)的22 kD蛋白同時具有水溶性葉綠素結(jié)合蛋白活性和胰蛋白酶抑制劑活性, 它能通過保持蛋白的完整性和正常的光合作用保護(hù)油菜幼嫩組織不受逆境的影響。這說明Drought inducible 22 kD protein和Stress-inducible protein表達(dá)量的上升對青海13號蠶豆的抗旱性發(fā)揮了重要的作用。在植物應(yīng)對非生物脅迫中活性氧(ROS)傷害植物的膜系統(tǒng)和體內(nèi)大分子, 是新陳代謝的有毒副產(chǎn)物, 而超氧化物歧化酶(SOD)是可解除脅迫條件下植物體內(nèi)產(chǎn)生的多余活性氧分子的一類重要的活性氧清除酶, 此類表達(dá)量的增加使植物減少或免除脅迫對植物的傷害, 提高其抗逆性[21-22]。我們發(fā)現(xiàn), 干旱脅迫下超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, spot 3106)被誘導(dǎo)表達(dá), 這與豌豆[23]、水稻[24]等作物中的研究結(jié)果一致, 是青海13號蠶豆品種對干旱脅迫的一種應(yīng)激性生理響應(yīng), 推測這也是青海13號具有強(qiáng)抗旱性的原因所在。熱激蛋白(heat shock protein, HSP)是干旱脅迫物質(zhì)形成的必需因子, 表達(dá)量的升高是植物適應(yīng)脅迫的一種機(jī)制,有利于維持脅迫調(diào)節(jié)下蛋白的穩(wěn)定性和維持植物生存與生長, 可以提高植株的抗逆能力, 在脅迫中的作用己經(jīng)被廣泛地研究[25-26]。研究者Sato和Yokoya[27]發(fā)現(xiàn)超表達(dá)sHSP17.7基因可提高干旱處理的水稻植株抗旱性,在水稻葉片蛋白質(zhì)組分析中也發(fā)現(xiàn)干旱脅迫調(diào)節(jié)多個熱激蛋白上調(diào)表達(dá)[28-29]。本研究中發(fā)現(xiàn)干旱脅迫使17.5 kD一級熱激蛋白(spot 3208)表達(dá)上調(diào), 這說明青海13號蠶豆在干旱脅迫下通過誘導(dǎo)熱激蛋白的增加來對逆境適應(yīng)起保護(hù)作用這也是該品種具有抗旱性的原因所在。氧乙酰絲氨酸裂解酶(0-acetylserin(thiol)lyase)是半胱氨酸合成最后一步的關(guān)鍵酶, 在半胱氨酸的合成調(diào)節(jié)中占據(jù)核心地位, 植物體內(nèi)的一些含硫化合物(如谷胱甘肽)可通過一些生化反應(yīng)途徑淬滅這些游離基團(tuán), 從而提高植物體的抗逆性, 我們在干旱脅迫處理下發(fā)現(xiàn)了差異上調(diào)表達(dá)蛋白中包括此蛋白(spot 5605)。干旱誘導(dǎo)蛋白是指植物在受到干旱脅迫時新合成或合成增多的一類蛋白, 干旱誘導(dǎo)蛋白的形成是植物抵御干旱脅迫的主動保護(hù)機(jī)制[30]。本研究發(fā)現(xiàn)在分離鑒定的眾多差異蛋白中, 莽草酸酯脫氫酶(shikimate dehydrogenase substrate binding, N-terminal, partial (ISS), spot 3809)是新產(chǎn)生的一類干旱誘導(dǎo)蛋白。莽草酸途徑是存在于植物中的一條重要的代謝途徑, 與植物應(yīng)對環(huán)境刺激相關(guān)聯(lián), 而莽草酸酯脫氫酶是一類促進(jìn)莽草酸途徑的關(guān)鍵性酶之一[31–32], 我們推測此干旱誘導(dǎo)蛋白對青海13號蠶豆的抗旱性有貢獻(xiàn)。植物抵抗環(huán)境脅迫的一個重要機(jī)制是調(diào)節(jié)基因的表達(dá), 嚴(yán)順平[24]在水稻抗逆性研究中推測新生肽結(jié)合蛋白復(fù)合物的α亞基(α-NAC)可能參與了水稻抗逆的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。也有證據(jù)表明新生肽結(jié)合復(fù)合物的α亞基可以作為轉(zhuǎn)錄的激活子[33], 在我們的研究中α-NAC (spot 408)在干旱脅迫下表達(dá)量上調(diào), 這可能影響了整個NAC的功能, 維持脅迫下基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯和定位的正常進(jìn)行, 保持了蠶豆正常的生理功能, 表現(xiàn)出了抗旱性。

光合作用是綠色植物產(chǎn)生糖類等各種有機(jī)物的起始反應(yīng),是蠶豆產(chǎn)量構(gòu)成的唯一來源, 對于干旱、鹽漬等很多非生物脅迫來說都是一個非常敏感的生物學(xué)過程[34-35], 所以在本研究中發(fā)現(xiàn)干旱脅迫處理引起許多參與光合作用的蛋白表達(dá)發(fā)生變化并不奇怪。我們通過蛋白質(zhì)組學(xué)的分析發(fā)現(xiàn),很多參與光合作用的蛋白在干旱脅迫下被降解或者差異表達(dá), 這也表明了光合作用對干旱脅迫信號也是非常敏感的。Chlorophyll/binding protein AB80 (spot 2306)、chlorophyll/binding protein 8 (spot 5314)和photosystem II repair protein PSB27-H1 (spot 8010)都是與光合系統(tǒng)密切相關(guān)的蛋白, 蛋白表達(dá)的下降也驗(yàn)證了在干旱脅迫下, 植物葉片的光合作用受到抑制。ATP合酶CFI亞基(spot 3815)是與能量代謝相關(guān)的酶, 這些ATP合酶亞基在干旱脅迫下被降解將不可避免地影響光合磷酸化產(chǎn)生ATP進(jìn)一步影響光合作用的卡爾文循環(huán)。在干旱脅迫條件下, 植物通過改變體內(nèi)的初級代謝如碳的能量代謝使其達(dá)到新的平衡狀態(tài)[36], 本研究發(fā)現(xiàn)參與糖代謝途徑的磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶, 轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase, TK, spot 5808)在干旱脅迫下表達(dá)量下調(diào), 說明干旱脅迫下磷酸戊糖途徑受到抑制。S-腺苷甲硫氨酸合酶2 (SAMS2)是植物合成木質(zhì)素的關(guān)鍵酶, 其下降表達(dá)表明木質(zhì)素以及其他相關(guān)的次生代謝產(chǎn)物的合成下降, 以利于減少不必要的能量和物質(zhì)的消耗。本研究中干旱脅迫下SAMS2 (spot 4707)蛋白表達(dá)下調(diào), 前人在研究水稻響應(yīng)鹽脅迫和干旱脅迫的蛋白質(zhì)組變化時也發(fā)現(xiàn)SAMS2的蛋白水平被下調(diào)[37], 推測此蛋白也與青海13號蠶豆抗旱性有關(guān)聯(lián)。

4 結(jié)論

在干旱脅迫下, 青海 13 號蠶豆葉片與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、自由基清除、防衛(wèi)反應(yīng)、能量代謝及蛋白加工等相關(guān)的蛋白主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)中發(fā)現(xiàn)了一個新的干旱脅迫響應(yīng)蛋白莽草酸酯脫氫酶(shikimate dehydrogenase substrate binding, N-terminal, partial (ISS), spot 3809), 推測是青海13號蠶豆具有抗旱性機(jī)制所在。這些為我們深入了解蠶豆對干旱脅迫的響應(yīng)提供了新的線索, 也是利用遺傳等手段進(jìn)一步研究這些基因功能的開始。

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Proteomic analysis of drought stress response on drought resistance forL. variety ‘Qinghai 13’ in Qinghai Plateau of China

LI Ping1,2, HOU Wan-Wei1,2, and LIU Yu-Jiao1,2,*

1Academy of Agriculture and Forestry Science of Qinghai University, Xining 810016, Qinghai, China;2State Key Laboratory of Plateau Ecology and Agriculture, Qinghai University, Xining 810016, Qinghai, China

Proteomics is playing an increasingly important role in the functional genomics era. Two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry can be used to study the changes of proteome of crop under stress and increase the recognization and comprehension of crop response to drought stress. In order to explore the mechanism of drought resistance ofL. variety ‘Qinghai 13’, we treated the seedlings with three days for water stress and analyzed by two-dimensional gel electrophoresis combined with mass spectrometry analysis. Bytest, 32 differentially expressed proteins spots were detected between normal and drought-stress treatments, respectively, including up- and down-regulated proteins, seven disappear protein spots and a new protein spot. Twenty-one differentially expressed proteins in seven function categories were identified and confirmed by MALDI-TOF/TOF. Among them, two participated in information transfer, one in oxygen radical scavenging, one in protective response, eight in energy metabolism, one in protein processing, five in photosynthesis, and three unknown in function. These results indicate that drought-inducible 22 kD protein, stress-inducible protein, superoxide dismutase and 17.5 kD class HSP are directly related with drought resistance, which may be the important reasons for strong drought resistance of ‘Qinghai 13’.

faba bean; drought stress; proteomic; differential expression; functional classification

): 2018-05-29;

2018-10-08;

2018-11-03.

10.3724/SP.J.1006.2019.84075

劉玉皎, E-mail: 13997058356@163.com

E-mail: lping2008@ sohu.com

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460377)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-09)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31460377) and the China Agriculture Research System (CARS-09).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20181031.1457.004.html