基于重測(cè)序的陸地棉InDel標(biāo)記開(kāi)發(fā)與評(píng)價(jià)

吳 迷 汪 念 沈 超 黃 聰 溫天旺 林忠旭

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基于重測(cè)序的陸地棉InDel標(biāo)記開(kāi)發(fā)與評(píng)價(jià)

吳 迷 汪 念 沈 超 黃 聰 溫天旺 林忠旭*

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 / 作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430070

堿基插入/缺失(InDel)是基因組中豐富的遺傳變異形式。InDel以其密度高、易于基因型分型等優(yōu)點(diǎn)成為分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的理想來(lái)源。本研究利用262份陸地棉品系重測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定的InDel位點(diǎn), 在全基因組范圍內(nèi)設(shè)計(jì)了3206個(gè)InDel標(biāo)記并挑選均勻分布的320個(gè)標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證。320個(gè)標(biāo)記篩選出87個(gè)多態(tài)性標(biāo)記, 多態(tài)性率為26.88%。利用多態(tài)性標(biāo)記對(duì)不同地理來(lái)源的262份陸地棉種質(zhì)資源進(jìn)行基因分型, 共檢測(cè)到160個(gè)等位位點(diǎn); 多態(tài)性信息含量(PIC)為0.0836~0.3750, 平均值為0.3073; 基因多樣性指數(shù)變異范圍為0.0874~0.5000, 平均值為0.3876, 表明我國(guó)陸地棉遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄。群體結(jié)構(gòu)分析將262份陸地棉品系大致劃分為2個(gè)亞群, 聚類分析和主成分分析的結(jié)果與之基本一致。采用混合線性模型(Mixed linear model)對(duì)6個(gè)纖維品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)到65個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)(< 0.01), 各位點(diǎn)對(duì)表型變異貢獻(xiàn)率為2.57%~8.12%。本研究旨在利用重測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)全基因組范圍的可用于凝膠檢測(cè)的InDel標(biāo)記, 為棉花種質(zhì)資源研究和分子標(biāo)記輔助選擇育種提供便捷工具。

陸地棉; InDel標(biāo)記; 遺傳多樣性; 群體結(jié)構(gòu); 關(guān)聯(lián)分析

棉花作為世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物, 是紡織制造業(yè)中天然纖維的主要來(lái)源。陸地棉()是棉花的主要栽培種。我國(guó)棉花育種史較短, 前期改良主要依賴于國(guó)外引種[1], 當(dāng)前選育和種植的大部分陸地棉品種多由美國(guó)引進(jìn)的岱字棉、斯字棉、金字棉等少數(shù)種質(zhì)資源衍生而來(lái), 這也導(dǎo)致我國(guó)陸地棉種質(zhì)資源相對(duì)匱乏、遺傳基礎(chǔ)較為狹窄、多樣性水平低[2]。為有效拓寬陸地棉的遺傳基礎(chǔ)、加快不同育種目標(biāo)下的棉花新品種選育及遺傳改良進(jìn)程, 將傳統(tǒng)育種方法和分子標(biāo)記輔助選擇育種方法結(jié)合是有效可行的。目前, 多種分子標(biāo)記如簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)等廣泛地應(yīng)用于棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)、親緣關(guān)系鑒定、遺傳圖譜的構(gòu)建、重要農(nóng)藝性狀QTL定位及圖位克隆和種質(zhì)鑒定等方面[3-4]。

InDel標(biāo)記是根據(jù)不同個(gè)體基因組同源序列發(fā)生的核苷酸片段插入或缺失而開(kāi)發(fā)的, 具有基因組內(nèi)分布廣、密度高、變異穩(wěn)定、可重復(fù)性好、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn), 在水稻[5]、玉米[6]、油菜[7]等作物中被廣泛應(yīng)用。2015年Zhang等[8]完成了異源四倍體陸地棉品種‘TM-1’全基因組測(cè)序及組裝工作。2017年Wang等[9]完成了352份棉花材料重測(cè)序, 同時(shí)發(fā)掘大量InDel變異位點(diǎn), 為全基因組范圍的InDel標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供了條件。

棉花許多重要的農(nóng)藝性狀如產(chǎn)量、纖維品質(zhì)、生育期等均為數(shù)量性狀, 解析復(fù)雜數(shù)量性狀的遺傳基礎(chǔ)主要有連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析兩種方法。關(guān)聯(lián)分析是一種以連鎖不平衡為基礎(chǔ), 鑒定自然群體目標(biāo)性狀與遺傳標(biāo)記關(guān)系的分析方法。它具有無(wú)需構(gòu)建作圖群體、省時(shí)省力、解析精度高等優(yōu)點(diǎn), 也是傳統(tǒng)連鎖分析QTL定位的有益補(bǔ)充。在棉花中, 國(guó)內(nèi)外廣泛開(kāi)展了關(guān)聯(lián)分析相關(guān)的研究工作[9-11], 然而這些研究大部分是基于SNP的, 利用InDel進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的研究相對(duì)較少。

本研究基于Wang等[9]的重測(cè)序結(jié)果, 篩選InDel變異位點(diǎn), 開(kāi)發(fā)覆蓋全基因組范圍的、可用于凝膠檢測(cè)的InDel標(biāo)記, 并對(duì)重測(cè)序的262份陸地棉材料進(jìn)行遺傳多樣性、親緣關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)的分析, 以及通過(guò)關(guān)聯(lián)分析挖掘與纖維品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的InDel標(biāo)記, 從而評(píng)價(jià)這些標(biāo)記在棉花遺傳和育種中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 供試材料及性狀表型數(shù)據(jù)

采用262份陸地棉種質(zhì)資源材料, 根據(jù)地理來(lái)源分類, 包括中國(guó)長(zhǎng)江流域棉區(qū)的75份、中國(guó)黃河流域棉區(qū)的118份、中國(guó)西北內(nèi)陸棉區(qū)的33份、中國(guó)北方特早熟棉區(qū)的17份、中國(guó)南方棉區(qū)的2份, 以及美國(guó)的11份和前蘇聯(lián)的6份[9]。依據(jù)Nie等[11]的SSR標(biāo)記在503份種質(zhì)材料中的擴(kuò)增結(jié)果, 挑選了24份多態(tài)性高的材料用于后續(xù)多態(tài)性標(biāo)記篩選, 這些材料比較全面地覆蓋了種質(zhì)材料的多態(tài)性信息, 利用24份材料作為參考, 可以快速篩選出具有代表性的多態(tài)性標(biāo)記。24份種質(zhì)材料編號(hào)分別為ZY40、ZY43、ZY54、ZY91、ZY121、ZY122、ZY211、ZY238、ZY240、ZY262、ZY320、ZY358、ZY361、ZY362、ZY376、ZY410、ZY413、ZY423、ZY434、ZY452、ZY468、ZY481、ZY495和ZY507。

種質(zhì)材料的表型數(shù)據(jù)在Nie等[11]的文章中已報(bào)道, 從中獲取了2年4點(diǎn)共8個(gè)環(huán)境下的表型數(shù)據(jù)及最佳線性無(wú)偏預(yù)測(cè)(BLUP)后的表型值, 8個(gè)環(huán)境分別為2012年湖北黃岡(E1)、2012年河南原陽(yáng)(E2)、2012年新疆庫(kù)爾勒(E3)、2012年新疆石河子(E4)、2013年湖北黃岡(E5)、2013年河南原陽(yáng)(E6)、2013年新疆庫(kù)爾勒(E7)和2013年新疆石河子(E8)。選取與纖維品質(zhì)相關(guān)的6個(gè)表型數(shù)據(jù), 分別為纖維上半部平均長(zhǎng)度(FUHML)、纖維比強(qiáng)度(FS)、纖維伸長(zhǎng)率(FE)、纖維整齊度(FU)、馬克隆值(MV)和短纖維率(SF)。

1.2 InDel標(biāo)記設(shè)計(jì)

基于Wang等[9]檢測(cè)的InDel位點(diǎn)集合, 篩選出測(cè)序深度大于7、插入/缺失堿基數(shù)大于30 bp且最小等位基因頻率大于0.05的InDel位點(diǎn)。提取InDel位點(diǎn)上下游150 bp序列, 將其中含有“N”的位點(diǎn)過(guò)濾。以Zhang等[8]發(fā)表的陸地棉標(biāo)準(zhǔn)品系‘TM-1’基因組序列為參考進(jìn)行比對(duì), 閾值設(shè)置為1×10–10, 選取完全匹配的InDel位點(diǎn)作為候選標(biāo)記開(kāi)發(fā)位點(diǎn)。使用Primer 3.0[12]設(shè)計(jì)引物, 引物長(zhǎng)度范圍為18~24 bp, GC含量范圍在40%~60%之間, 退火溫度范圍為54~60℃。最后, 去除位于scaffold上的引物及SSR引物。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

從田間取幼嫩葉片, 參照Li等[13]改良的CTAB法提取基因組DNA。以微量分光光度計(jì)Nanodrop 2000檢測(cè)其質(zhì)量和濃度, 并稀釋至終濃度20~40 ngμL–1, 于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用10 μL PCR擴(kuò)增體系, 其中包括1×reaction buffer、0.8 mmol L–1MgCl2、0.25 mmol L–1dNTPs、2.5 nmol L–1primers、25 ng DNA、0.5 UDNA polymerase (上海博彩生物科技有限公司)。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min; 然后95℃變性50 s, 退火45 s (根據(jù)不同引物設(shè)置退火溫度), 72℃延伸60 s, 34個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸5 min, 15℃保存。用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物, 銀染檢測(cè)分離條帶。

以人工讀帶, 同一位置上清晰且重復(fù)性好的條帶記為“1”, 無(wú)帶記為“0”, 缺失數(shù)據(jù)記為“–”。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用POWERMARKER V3.25軟件[14]計(jì)算多態(tài)性信息含量(polymorphic information content, PIC)和基因多樣性指數(shù); 計(jì)算各種質(zhì)材料間Nei’s遺傳距離,依據(jù)距離矩陣構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù), 進(jìn)行Neighbor- Joining聚類分析, iTOL[15]用于繪制和編輯聚類圖。

利用STRUCTURE 2.3.4軟件[16]計(jì)算各種質(zhì)材料相應(yīng)的Q值, 用于分析自然群體遺傳結(jié)構(gòu)。設(shè)置組群數(shù)值為1~10, 每個(gè)值獨(dú)立重復(fù)運(yùn)算7次, 將MCMC (Markov Chain Monte Carlo)開(kāi)始時(shí)的不作數(shù)迭代(Length of burn-in period)設(shè)為100,000次, 再將不作數(shù)迭代后的MCMC設(shè)為100,000次; 利用STRUCTURE HARVESTER[17]分析輸出數(shù)據(jù), 依據(jù)ln()和Δ值來(lái)確定最佳K值[18]。

利用TASSEL 5.0軟件[19]進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis, PCA), 估算PCA矩陣對(duì)表型變異的解釋率。同時(shí), 以群體結(jié)構(gòu)(Q)和親緣關(guān)系()為協(xié)變量的混合線性模型(MLM)進(jìn)行性狀-基因型的關(guān)聯(lián)分析, 計(jì)算各標(biāo)記位點(diǎn)在<0.01時(shí)對(duì)表型變異的貢獻(xiàn)率(2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 InDel標(biāo)記開(kāi)發(fā)及多態(tài)性分析

基于Wang等[9]重測(cè)序檢測(cè)的InDel位點(diǎn), 篩選并開(kāi)發(fā)了3206個(gè)InDel標(biāo)記, 可在網(wǎng)頁(yè)(http://cotton. hzau.edu.cn/EN/download.php)中下載標(biāo)記的相關(guān)信息, 文件名稱為“ZY_InDels data”。在棉花基因組中平均每隔5.88 Mb挑選一個(gè)標(biāo)記, 最終挑選出均勻分布于26條染色體的320個(gè)標(biāo)記進(jìn)行合成。

利用24份多態(tài)性高的種質(zhì)材料進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記的初步篩選, 檢測(cè)到87個(gè)多態(tài)性標(biāo)記, 占總標(biāo)記數(shù)的26.88%, 詳細(xì)信息見(jiàn)附表1。多態(tài)性標(biāo)記涵蓋了整個(gè)棉花基因組, 每條染色體至少一個(gè)標(biāo)記, 平均每條染色體上3.35個(gè)。圖1為標(biāo)記HAU_ID_ D11-01在部分材料中的擴(kuò)增結(jié)果。其他230個(gè)標(biāo)記無(wú)多態(tài)性, 3個(gè)標(biāo)記沒(méi)有得到擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1 標(biāo)記HAU_ID_D11-01在部分品系中擴(kuò)增結(jié)果

2.2 遺傳多樣性分析

利用87個(gè)多態(tài)性標(biāo)記對(duì)262份棉花種質(zhì)資源材料進(jìn)行基因型分析, 共檢測(cè)到160個(gè)等位變異位點(diǎn), 平均每對(duì)標(biāo)記1.84個(gè)。基因多樣性指數(shù)變幅為0.0874 (HAU_ID_D07-04)~0.5000 (HAU_ID_D05- 08), 平均值為0.3876; 多態(tài)性信息含量(PIC)變幅為0.0836 (HAU_ID_D07-04)~0.3750 (HAU_ID_A07- 02), 平均值為0.3073 (附表1)。

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析

ln()值隨假定亞群數(shù)值(1~10)的增大而持續(xù)增大。在=2時(shí)Δ達(dá)到最大(圖2), 由此, 在遺傳結(jié)構(gòu)上將262份棉花種質(zhì)材料劃分為POP-1和POP-2兩個(gè)亞群, 繪制供試材料的群體結(jié)構(gòu)圖(圖3)。POP-1包含175份材料, 黃河流域棉區(qū)(84份)和長(zhǎng)江流域棉區(qū)(71份)的種質(zhì)材料占該組的88.57%; POP-2包含87份材料, 黃河流域棉區(qū)(34份)、西北內(nèi)陸棉區(qū)(23份)和北方特早熟棉區(qū)(13份)的種質(zhì)材料占該組的80.46%。每個(gè)亞群都包含不同種植區(qū)域的種質(zhì)材料, 但同時(shí)又以同一種植區(qū)域的種質(zhì)材料為主。

主成分分析(PCA)中PC1、PC2分別解釋了個(gè)體變異的7.58%和4.55%。以PC1為x軸、PC2為y軸構(gòu)建一個(gè)二維坐標(biāo)圖(圖4)。種質(zhì)材料大致上可分為2個(gè)集群, 一個(gè)以長(zhǎng)江流域棉區(qū)和黃河流域棉區(qū)的種質(zhì)材料為主, 另一個(gè)以黃河流域棉區(qū)、西北內(nèi)陸棉區(qū)和北方特早熟棉區(qū)的種質(zhì)材料為主。不同來(lái)源的材料在一定程度上相對(duì)獨(dú)立, 而伴隨育種過(guò)程中的基因交換和基因滲入, 材料互相混合。PCA觀察結(jié)果與STRUCTURE軟件的分析結(jié)果較為一致。

圖2 K值與ln P(D)、ΔK值折線圖

A: ln()與值變化折線圖; B: Δ值隨值變化折線圖。

A: Line chart of ln() value with change of; B: Line chart of Δvalue with change of.

2.4 基于遺傳距離的聚類分析

262份材料的Nei’s遺傳距離(Genetic distance, GD)平均為0.499, 最高為1.075, 最低為0.012。遺傳距離最高的材料均來(lái)自黃河流域棉區(qū), 分別是ZY31 (晉棉13)和ZY297 (晉棉9)。基于距離矩陣構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù), Neighbor-Joining聚類圖(圖5)顯示262份陸地棉材料可以劃分為G1 (紅色線條)和G2 (綠色線條)兩大類群, G1包含182份種質(zhì)材料(中國(guó)黃河流域棉區(qū)93份、中國(guó)長(zhǎng)江流域棉區(qū)70份、中國(guó)西北內(nèi)陸棉區(qū)7份、中國(guó)北方特早熟棉區(qū)5份、美國(guó)5份、前蘇聯(lián)2份); G2包含80份種質(zhì)材料(中國(guó)黃河流域棉區(qū)25份、中國(guó)長(zhǎng)江流域棉區(qū)5份、中國(guó)西北內(nèi)陸棉區(qū)26份、中國(guó)北方特早熟棉區(qū)12份、中國(guó)南方棉區(qū)2份、美國(guó)6份、前蘇聯(lián)4份), 該組材料來(lái)源更為豐富, 其平均遺傳距離也更高。總體來(lái)看, 262份種質(zhì)材料的聚類分析結(jié)果與系譜信息相吻合。

圖3 基于InDel標(biāo)記的262份陸地棉品系群體結(jié)構(gòu)圖

圖4 基于InDel標(biāo)記的262份陸地棉品系的PCA圖

NIR: 中國(guó)西北內(nèi)陸棉區(qū); NSEMR: 中國(guó)北方特早熟棉區(qū); SCR: 中國(guó)南方棉區(qū); SU: 前蘇聯(lián); USA: 美國(guó); YRR: 中國(guó)黃河流域棉區(qū); YtRR: 中國(guó)長(zhǎng)江流域棉區(qū)。

NIR: Northwestern Inland Region of China; NSEMR: Northern Specific Early Maturation Region of China; SCR: South China Region; SU: Former Soviet Union; USA: American; YRR: Yellow River Region of China; YtRR: Yangtze River Region of China.

圖5 基于遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

紅色線條: G1, 包含182份種質(zhì)材料; 綠色線條: G2, 包含80份種質(zhì)材料。

Red lines: group 1, including 182 accessions; Green lines: group 2, including 80 accessions.

2.5 性狀-標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

采用TASSEL 5.0軟件中MLM(Q+K)模型進(jìn)行性狀-標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析。表型性狀包括E1~E8和最佳線性無(wú)偏預(yù)測(cè)(BLUP)的表型值。在<0.01顯著條件下, 共檢測(cè)到65個(gè)與纖維品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)(附表2)。與上半部纖維長(zhǎng)度相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有12個(gè), 在不同環(huán)境中對(duì)表型變異解釋率范圍為2.97% (HAU_ID_D12-10)~5.92% (HAU_ID_D09-10), 平均值為3.43%。對(duì)其余5個(gè)纖維品質(zhì)性狀, FS、FE、FU、MV和SF分別檢測(cè)到7、13、10、9和14個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn),表型變異的解釋率范圍分別為2.57%~7.36%、2.61%~5.66%、2.74%~8.12%、2.72%~5.58%和2.66%~ 6.99%。65個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中, 有23個(gè)至少能在2個(gè)環(huán)境中被檢測(cè)到, 有11個(gè)至少能在4個(gè)環(huán)境中被檢測(cè)到。其中, 標(biāo)記HAU_ID_D02-06與FE在8個(gè)環(huán)境中均被檢測(cè)到關(guān)聯(lián), 標(biāo)記HAU_ID_D12-10與FU在6個(gè)環(huán)境中被檢測(cè)到關(guān)聯(lián), 標(biāo)記HAU_ID_A01-15與FL在5個(gè)環(huán)境中被檢測(cè)到關(guān)聯(lián)。

同一標(biāo)記位點(diǎn)與多種性狀相關(guān)聯(lián)可能是多效性引起的。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)19個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)為多效應(yīng)位點(diǎn), 這些位點(diǎn)至少與2個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)(表1)。其中, 標(biāo)記HAU_ID_D07-09同時(shí)與5個(gè)性狀(FUHML、FS、FE、FU、SF)相關(guān)聯(lián); 標(biāo)記HAU_ID_D12-10同時(shí)與4個(gè)性狀(FUHML、FS、FU、SF)相關(guān)聯(lián); 5個(gè)標(biāo)記同時(shí)與3個(gè)性狀相關(guān)聯(lián), 分別為HAU_ID_A01-15 (FUHML、FU和SF)、HAU_ID_A03-09 (FE、FU和SF)、HAU_ID_A10-09 (FS、FU和MV)、HAU_ID_ D06-06 (FUHML、FU和SF)和HAU_ID_D06-07 (FUHML、FU和SF); 其余12個(gè)位點(diǎn)與2個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)。

表1 多效應(yīng)標(biāo)記位點(diǎn)

3 討論

3.1 InDel標(biāo)記開(kāi)發(fā)及應(yīng)用

InDel變異廣泛存在于基因組中, 其多態(tài)性頻率僅次于SNP。InDel標(biāo)記以其密度大、準(zhǔn)確性高、具共顯性、檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)快速和高效等特點(diǎn)成為分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的寶貴資源。2017年Wang等[9]對(duì)352份種質(zhì)材料進(jìn)行重測(cè)序, 我們挑選了其中262份陸地棉材料進(jìn)行InDel標(biāo)記開(kāi)發(fā), 由于中等大小的插入/缺失位點(diǎn)易于利用凝膠電泳進(jìn)行基因分型, 參考Wu等[20]的InDel篩選標(biāo)準(zhǔn), 篩選出插入/缺失片段長(zhǎng)度大于30 bp的InDel位點(diǎn), 并將之轉(zhuǎn)化為基于PCR的可用于凝膠檢測(cè)的InDel標(biāo)記, 最終設(shè)計(jì)了3206個(gè)InDel標(biāo)記并從中挑選了均勻分布于基因組的320個(gè)InDel標(biāo)記用于多態(tài)性驗(yàn)證。

為了快速篩選多態(tài)性標(biāo)記, 我們根據(jù)Nie等[11]的SSR標(biāo)記在503份種質(zhì)材料中的擴(kuò)增結(jié)果, 挑選出具有代表性的、材料間多態(tài)性豐富的24份種質(zhì)用于標(biāo)記篩選。以320個(gè)InDel篩選到87個(gè)多態(tài)性標(biāo)記, 多態(tài)性比例為26.88%。在陸地棉中, Wang等[21]基于RAD-seq測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)了121對(duì)InDel標(biāo)記, 兩親本間多態(tài)性率為25.62%, 與本研究結(jié)果相似, 均呈現(xiàn)出一個(gè)較低的多態(tài)性水平。從實(shí)驗(yàn)方法上來(lái)看, 本研究?jī)H采用24份種質(zhì)材料篩選多態(tài)性標(biāo)記, 會(huì)導(dǎo)致部分標(biāo)記的多態(tài)性不能被檢測(cè)。同時(shí), 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)標(biāo)記的多態(tài)性, 受凝膠的分辨率及分離效果等因素影響, 導(dǎo)致多態(tài)性標(biāo)記的識(shí)別能力不夠。此外, 陸地棉是異源四倍體物種, 基因組較為復(fù)雜, A亞組和D亞組間同源性程度較高, 在目前的基因組序列質(zhì)量還不夠完善的情況下, 重測(cè)序的序列同基因組序列比對(duì)時(shí)可能將來(lái)自不同亞組的序列比對(duì)到同一位置, 造成假陽(yáng)性, 因而無(wú)法檢測(cè)到標(biāo)記的多態(tài)性。但與以往在陸地棉種內(nèi)開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記多態(tài)性率(2.5%~6.3%)相比[21-23], 基于重測(cè)序開(kāi)發(fā)的InDel標(biāo)記多態(tài)性率有所提高, 該研究結(jié)果為將來(lái)陸地棉引物的開(kāi)發(fā)提供了參考。

目前, SSR標(biāo)記及SNP標(biāo)記在棉花的遺傳資源評(píng)價(jià)、種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位與圖位克隆[22,24-25]等方面廣泛應(yīng)用, 而InDel標(biāo)記則報(bào)道較少。新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用, 為棉花基因組測(cè)序及高密度InDel標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了良好的條件[8-9],可以預(yù)見(jiàn)InDel標(biāo)記將有廣闊的應(yīng)用前景。

3.2 遺傳多樣性分析

種質(zhì)資源是作物遺傳改良的基礎(chǔ), 由于陸地棉品種同質(zhì)性較強(qiáng), 遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄, 分析陸地棉種質(zhì)資源材料的遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系對(duì)拓寬棉花種質(zhì)基礎(chǔ)及棉花育種起到重要作用。

本研究篩選的87個(gè)InDel標(biāo)記均勻分布于棉花基因組上。基因多樣性指數(shù)分布在0.087,4到0.500,0之間; 多態(tài)性信息含量分布在0.083,6到0.387,6之間, 均值為0.307,3, 能夠較為全面地分析陸地棉的遺傳多樣性。此前, Huang等[10]以63,058個(gè)SNPs對(duì)503份種質(zhì)資源材料進(jìn)行分析, PIC值變幅為0.279~0.369, 均值為0.332。Fang等[24]挑選448對(duì)SSR標(biāo)記分析了193份地理來(lái)源不同的陸地棉材料, PIC均值為0.29, 根據(jù)資料考證, 他們指出自20世紀(jì)以來(lái)美國(guó)陸地棉品種的遺傳多樣性逐漸下降。Ai等[26]和Tyagi等[27]的結(jié)果也表明陸地棉遺傳多樣性水平普遍偏低。本研究與前人研究結(jié)果基本一致。

3.3 聚類分析和群體結(jié)構(gòu)分析

基于InDel標(biāo)記的聚類分析將262份種質(zhì)材料大致劃分為兩類(圖5)。聚類結(jié)果往往受到群體大小及群體內(nèi)成員構(gòu)成差異等因素的影響, 2017年Wang等[9]基于全基因組SNP標(biāo)記將352份種質(zhì)材料劃分為兩類, 能有效地將中國(guó)與國(guó)外的種質(zhì)及野生種質(zhì)區(qū)分開(kāi)。本研究所采用的262份種質(zhì)材料是從352份材料中挑選得來(lái)的陸地棉, 剔除了大量野生種質(zhì)及國(guó)外種質(zhì), 僅與Wang等[9]的國(guó)內(nèi)種質(zhì)材料聚類模式相比, 聚類結(jié)果較為一致, 均能將多數(shù)西北內(nèi)陸棉區(qū)、北方特早熟棉區(qū)的材料與其他材料區(qū)分開(kāi)。同時(shí), 我們發(fā)現(xiàn)G1組89.6%的材料來(lái)源于長(zhǎng)江流域和黃河流域, 由于地理位置相近、基礎(chǔ)種質(zhì)資源相同或相似及育種過(guò)程中的人工定向選擇, 使得這兩大棉區(qū)的材料遺傳距離相近, 遺傳差異較小, 更加傾向于聚在一簇。G2組中不同地理來(lái)源的材料互相混合, 多數(shù)材料遺傳距離較遠(yuǎn)。后續(xù)可考慮通過(guò)加強(qiáng)不同棉區(qū)的種質(zhì)交流、加強(qiáng)國(guó)外引種力度來(lái)有效豐富我國(guó)棉花品種的遺傳多樣性。

對(duì)群體結(jié)構(gòu)的正確評(píng)估是進(jìn)行復(fù)雜性狀關(guān)聯(lián)分析的前提[28]。群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明262份材料可大致分為2個(gè)亞群, 與聚類分析結(jié)果相對(duì)比, POP-1與G1、POP-2與G2共有的種質(zhì)材料分別為161份和66份, 重疊率分別為88.46%和82.50%。本研究結(jié)合了STRUCTURE、聚類分析及主成分分析(PCA)這3種方法對(duì)群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析, 結(jié)果一致性較好, 可有效避免由群體結(jié)構(gòu)分層、等位基因分布不均等造成的標(biāo)記與性狀間的虛假關(guān)聯(lián)。

3.4 關(guān)聯(lián)分析

產(chǎn)量和纖維品質(zhì)是陸地棉主要的育種目標(biāo)性狀, 多是復(fù)雜的數(shù)量性狀, 受環(huán)境影響較大, 遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜。近年來(lái), 關(guān)聯(lián)分析廣泛應(yīng)用到棉花各性狀尤其是纖維品質(zhì)性狀QTL定位中, 并挖掘到很多與陸地棉纖維品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL[4, 9-11]。不同的關(guān)聯(lián)分析方法得到的結(jié)果不盡相同。以群體結(jié)構(gòu)(Q)和親緣關(guān)系(K)作為協(xié)變量的MLM (Q+K)優(yōu)于GLM (Q)和MLM(K), 能有效降低關(guān)聯(lián)的假陽(yáng)性, 提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和真實(shí)性[29]。

本研究利用多環(huán)境的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)記-性狀的關(guān)聯(lián)分析。36個(gè)標(biāo)記共檢測(cè)到65個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)(<0.01), 各位點(diǎn)對(duì)表型變異的解釋率為2.57%~ 8.12%。標(biāo)記的開(kāi)發(fā)是基于Wang等[9]的重測(cè)序數(shù)據(jù), 故參照其結(jié)果設(shè)置LD, 將置信區(qū)間設(shè)置為±296 kb。與前人的研究結(jié)果比較后發(fā)現(xiàn)8個(gè)位點(diǎn)已有報(bào)道, 其中4個(gè)位點(diǎn)與本研究關(guān)聯(lián)到相同性狀。其余28個(gè)位點(diǎn)可能是一些新的標(biāo)記位點(diǎn), 有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4個(gè)具有相同關(guān)聯(lián)性狀的標(biāo)記中, 一個(gè)標(biāo)記(HAU_ID_D05-02)與馬克隆值相關(guān), 且在5個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到關(guān)聯(lián), 該標(biāo)記位點(diǎn)(Pos: D05_13953192)和Ma等[30]檢測(cè)到的位點(diǎn)(Pos: D05_13941003)十分相近, 表型變異解釋率達(dá)5.58%。其他3個(gè)標(biāo)記(HAU_ ID_A07-02、HAU_ID_D02-01、HAU_ID_D04-07)都與纖維伸長(zhǎng)率相關(guān), 其中, 標(biāo)記HAU_ID_A07-02在4個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到關(guān)聯(lián), 表型變異解釋率為3.95%,該位點(diǎn)被Zhang等[31]和Fang等[32]共同檢測(cè); 標(biāo)記HAU_ID_D02-01表型變異解釋率為3.10%, 與Ma等[30]共同檢測(cè); 標(biāo)記HAU_ID_D04-07在5個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到關(guān)聯(lián), 表型變異解釋率達(dá)5.22%, 該關(guān)聯(lián)位點(diǎn)在Wang等[9]、Huang等[10]以及其他兩篇報(bào)道[33-34]中共同檢測(cè)。2013年Liu等[35]鑒定到一個(gè)參與赤霉素信號(hào)響應(yīng)的基因GhGASL, 組織表達(dá)模式分析表明該基因在棉花纖維中特異性表達(dá), 可能參與纖維發(fā)育早期的纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng), 將該基因的特異性引物比對(duì)到‘TM-1’基因組[8]上, 引物位點(diǎn)(Pos: D04_47893998)與本研究的標(biāo)記位點(diǎn)HAU_ID_ D04-07 (Pos: D04_47451029)緊密連鎖。

在不同報(bào)道中能夠重復(fù)檢測(cè)到的位點(diǎn)支撐了本研究的關(guān)聯(lián)結(jié)果, 這些關(guān)聯(lián)位點(diǎn)具有可重復(fù)性和穩(wěn)定性, 可用于QTL精細(xì)定位中候選區(qū)間的確定, 同時(shí)有助于后期分子設(shè)計(jì)育種中材料的選擇及鑒定。此外, 本研究檢測(cè)到19個(gè)多效應(yīng)位點(diǎn)同樣值得關(guān)注, 例如位于D12染色體的標(biāo)記HAU_ID_D12-10, 與之關(guān)聯(lián)的4個(gè)性狀(FUHML、FS、FU、SF)能在多個(gè)環(huán)境中穩(wěn)定檢測(cè), 且標(biāo)記對(duì)性狀表型變異解釋率處于相對(duì)較高的水平。這些多效應(yīng)位點(diǎn)為解析不同性狀之間的基因網(wǎng)絡(luò)及遺傳聯(lián)系提供參考依據(jù), 對(duì)指導(dǎo)育種中多性狀協(xié)同改良具有重要價(jià)值。

4 結(jié)論

基于全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)了3206個(gè)InDel標(biāo)記, 挑選320個(gè)標(biāo)記進(jìn)行合成并檢測(cè)到87個(gè)多態(tài)性標(biāo)記, 在陸地棉種內(nèi)標(biāo)記開(kāi)發(fā)中呈現(xiàn)較高的多態(tài)性水平。262份陸地棉種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析表明種質(zhì)材料的遺傳基礎(chǔ)較為狹窄。群體結(jié)構(gòu)分析將種質(zhì)材料大致劃分為2個(gè)亞群, 與基于遺傳距離的聚類分析及主成分分析的結(jié)果相同。關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)到65個(gè)與纖維品質(zhì)性狀顯著相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn), 其中23個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)能在多個(gè)環(huán)境中被重復(fù)穩(wěn)定檢測(cè)到。結(jié)果表明了基于重測(cè)序開(kāi)發(fā)InDel標(biāo)記是有效可行的, 本研究開(kāi)發(fā)的標(biāo)記為進(jìn)一步解析陸地棉纖維品質(zhì)的遺傳機(jī)理提供了理論依據(jù), 為棉花分子標(biāo)記輔助育種提供了高效便捷的基因組工具。

附表 請(qǐng)見(jiàn)網(wǎng)絡(luò)版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb. chinacrops.org/; 2)中國(guó)知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬(wàn)方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb. aspx。

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Development and evaluation of InDel markers in cotton based on whole-genome re-sequencing data

WU Mi, WANG Nian, SHEN Chao, HUANG Cong, WEN Tian-Wang, and LIN Zhong-Xu*

National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China

Insertion and deletion (InDel) are abundant forms of genetic variation in the genome. InDel has been recognized as an ideal source for marker development due to its high-density distribution and genotyping efficiency. In this study, the whole genome re-sequencing data of 262 upland cotton accessions were applied to identify 3206 InDel markers, and 320 markers with uniform distribution across the genome were selected to be evaluated. Eighty-seven polymorphic markers were identified, accounting for 26.88% of screened markers. A total of 160 allelic loci were detected using the 87 polymorphic markers in the 262 upland cotton accessions with an average polymorphic information content (PIC) of 0.3073 (ranging from 0.0836 to 0.3750) and an average genetic diversity of 0.3876 (ranging from 0.0874 to 0.5000), indicating a relatively low genetic diversity. Population structure analysis revealed extensive admixture and identified two subgroups, clustering analysis and principal component analysis supported the subgroups identified by STRUCTURE. Association analysis were performed by MLM (Mixed linear model), and 65 marker loci were associated with fiber quality traits (< 0.01), explaining 2.57%–8.12% of the phenotypic variation. Genome-wide and gel based InDel markers developed based on re-sequencing data in this study provide a facile tool for cotton germplasm resources research and molecular marker assisted selection breeding.

Upland cotton; InDel marker; genetic diversity; population structure; association analysis

2018-07-19;

2018-10-08;

2018-11-16.

10.3724/SP.J.1006.2019.84100

林忠旭, E-mail: linzhongxu@mail.hzau.edu.cn

E-mail: 656542680@qq.com

本研究由湖北省技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)(2018ABA082)資助。

This study was supported by the Technology Innovation Program of Hubei Province (2018ABA082).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20181115.1104.002.html