miR-10b和BDNF對山羊卵巢顆粒細胞活性的影響

魏金銷，張 月，方 芳，譚旭信，郭宏文，郭利亞，張曉建，安小鵬，曹斌云，白躍宇,,5*

(1.河南省種牛遺傳性能測定中心，河南 鄭州 450046；2.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100；3.河南省畜產品質量監(jiān)測檢驗中心，河南 鄭州 450008；4.河南科技學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；5.河南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 鄭州 450008)

卵巢作為雌性動物的重要繁殖器官，能夠直接決定繁殖性能的高低。在卵泡發(fā)育過程中，卵母細胞體積不斷增大并逐步發(fā)育成熟，伴隨這一過程的還有圍繞它周圍的顆粒細胞的增殖和分化。卵巢顆粒細胞是卵巢中的一種重要體細胞，它的生長發(fā)育受錯綜復雜的細胞信號系統(tǒng)調控，在促性腺激素等的調控下對卵泡發(fā)育有重要影響。目前研究表明許多卵巢外和卵巢內的因子參與了這一卵泡發(fā)育調控過程，如腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neuotrophic factor, BDNF)等[12]。

成熟的MicroRNAs (miRNAs)是一類長約20～24 nt的非編碼單鏈RNA分子，主要通過轉錄后的調控方式抑制或促進基因表達[1]。miRNAs的作用機制主要有3種，即翻譯起始抑制[2]、翻譯起始后抑制[3-5]和靶mRNA降解[6-7]。在動物中，miRNAs結合位點通常位于靶mRNA的3'UTR區(qū)[8-9]。miRNAs主要通過與靶基因mRNA的3'UTR區(qū)不完全配對結合，調控許多生物學過程。大量研究表明miRNAs對動物卵巢、輸卵管、子宮等與繁殖相關的組織器官的生長發(fā)育具有重要調節(jié)作用[10-11]。

繼神經生長因子(nerve growth factor，NGF)發(fā)現(xiàn)后，Barde等[12]從豬腦中分離純化到了第二種神經營養(yǎng)因子，即腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)。BDNF與NGF、神經營養(yǎng)素-3 (neurotroph-3, NT-3)、NT4/5、NT-6和NT-7等同屬于神經生長因子家族，又稱神經營養(yǎng)素 (Neurotrophins, NTs)[13]。眾所周知，BDNF調節(jié)感覺神經元、小腦神經元及髓前角運動神經元的存活和分化，對神經元的生長、分化和存活具有重要作用[14]。最近的研究表明，BDNF也在心血管、免疫、內分泌和生殖系統(tǒng)等非神經系統(tǒng)表達，BDNF及其受體在各發(fā)育時期的卵泡中也被發(fā)現(xiàn)，說明BDNF對除神經細胞以外的細胞也具有作用[15]。

越來越多的研究證明BDNF有助于卵泡發(fā)育，如促進卵泡顆粒細胞的增殖以及原始卵泡的生長，維持間質細胞的活性，誘導促卵泡素受體(FSHR)的產生[16]。BDNF及其受體酪氨酸蛋白激酶B(TrkB)可能是聯(lián)系卵泡形成時卵母細胞與卵泡顆粒細胞的一種信號分子。Ojeda等[17]利用基因敲除方法研究BDNF對大鼠卵泡發(fā)育的影響，首次證明了BDNF及TrkB表達于人初級卵泡和次級卵泡的顆粒細胞，說明BDNF在早期卵泡的生成和發(fā)育中具有重要作用。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，miR-10b通過轉錄后的調控方式調節(jié)BDNF基因的表達，進而調節(jié)卵巢內顆粒細胞和卵母細胞的生長、分化以及細胞間的相互作用而影響早期卵泡的發(fā)育。

本研究擬從建立的多羔(3～5只)和單羔奶山羊發(fā)情期卵巢組織差異表達microRNA文庫中篩選出差異表達顯著的miR-10b，并利用生物信息學和實時定量PCR等技術研究miR-10b對BDNF的表達和卵巢顆粒細胞活性的影響，為提高奶山羊產羔率提供試驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒與細胞

本試驗所用的奶山羊卵巢顆粒細胞采自楊凌屠宰場，新鮮屠宰的奶山羊卵巢組織浸入PBS中，在2 h之內帶回試驗室處理。pRL-TK載體由實驗室保存，pGL3-Control載體購自美國Promega公司，pMDTM19-T Vector購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 試劑及儀器

PCR試劑(Biotake公司)、miR-10b mimics和miR-10b control(廣州銳博生物科技有限公司)、雙熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega公司)、DMEM/F12、Opti-MEM○RI、胎牛血清(Gibco公司)、腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)(PeppoTECH公司)、二甲基亞砜 (DMSO)、胰蛋白酶(Hyclone公司)、LipofectamineTM2000、青-鏈霉素、Real Time PCR試劑盒(上海Invitrogen公司)、一抗Rabbit Anti-FSHR(北京博奧森公司)、SABC-cy3兔免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)、核酸染料(百泰克(北京)生物技術有限公司)、反轉錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix)、miRNA反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、T4 DNA連接酶、RNA提取試劑(RNAiso Plus)、XbaⅠ內切酶(Takara公司)、普通質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、E.coliDH5α感受態(tài)細胞、蛋白胨、酵母提取物、IPTG和X-gal和瓊脂粉(Agar)(生工生物工程(上海)有限公司)、DNA marker(康為世紀生化科技有限公司)、瓊脂糖(美國HydraGene公司)。

主要儀器有PCR擴增儀(96 Well，ABI公司)、實時定量儀(Bio-rad公司)、CO2培養(yǎng)箱(Thermo forma)、倒置顯微鏡(Nikon)、多標記微孔板檢測儀(PerkinElmer)、常溫高速離心機(Eppendorf)、低溫冷凍離心機(Beckman)、凝膠成像儀(百晶生物)、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一)、恒溫培養(yǎng)振蕩器(SUNKUN公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 miR-10b的差異表達與靶基因的預測 差異表達miRNAs文庫和實時定量PCR驗證由杭州聯(lián)川生物技術有限公司完成。利用Targetscan(http://www.targetscan.org/index.html)、RNAhybrid (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)、Mirnaviewe (http://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl)和Pictar (http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/new)等在線預測軟件對小鼠miR-10b靶基因進行預測。

由表6可知，飼喂復方阿膠漿藥渣對驢心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、肺臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、胰臟指數(shù)及腸指數(shù)均沒有顯著影響（P＞0.05)；但驢胃指數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05)；脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)均有明顯增加趨勢（0.05＜P＜0.1)。

1.3.2BDNF3'UTR片段的克隆與BDNF3'UTR熒光素酶報告基因載體的構建 根據GenBank中牛BDNFmRNA全序列( GenBank號: NM_001046607) ，應用Primer Premier 5.0設計引物，通過PCR擴增BDNF3 'UTR全長，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。反應體系：2×Taq MasterMix 7.5 μL，靶基因上、下游引物各0.5 μL，cDNA 50 ng，DNAase-free dH2O到15 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；35個循環(huán)(94 ℃ 35 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s)；72 ℃延伸10 min。取2 μL回收的PCR產物和1 μL pMDTM19-T Vector按照說明書與5 μl Solution Ⅰ和2 μL dH2O混成10 μL體系。16 ℃連接30 min后，將連接產物轉化涂板。37 ℃培養(yǎng)14 h后，挑取單克隆搖菌，通過菌液PCR鑒定并送至上海生工生物工程有限公司測序，測序結果用DNAstar軟件和Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast)分析，驗證片段的正確性。

利用XbaⅠ內切酶分別對提取得到的pGL3-control載體和pMD 19-3'UTR進行酶切。酶切體系：1 μLXbaⅠ、2 μL 0.1% BSA、2 μL 10×M Buffer、1 μL DNA和9 μL ddH2O，37 ℃恒溫酶切3 h，膠回收。分別取10 μL目的片段、2 μL報告質粒回收產物、1 μL T4 DNA Ligase、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer和ddH2O混成20 μL體系，16 ℃連接30 min。將連接產物轉化涂板，PCR、測序鑒定陽性克隆。

1.3.3 細胞培養(yǎng)及轉染 用含10% 胎牛血清的DMEM高糖生長培養(yǎng)基在37 ℃、 5% CO2的條件培養(yǎng)奶山羊卵巢顆粒細胞。及時檢查細胞貼壁和生長情況，每24 h更換培養(yǎng)液。將GCs以5×105的接種量接種至24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)液，轉染時的細胞密度達到50%。 按照lipofectamineTM2000說明書，用50 μL不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM○RⅠ分別稀釋pGL3-BDNF 3'UTR、pRL-TK、miRNA mimics/NC和脂質體，混勻靜置5 min后，將二者混勻，靜置 20 min后，將轉染混合物均勻滴加到細胞中，4～6 h后換生長培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～96 h。

1.3.4 總RNA提取及實時定量PCR 吸去培養(yǎng)基后用PBS洗去死細胞；每10 cm生長的培養(yǎng)細胞加入1 mL RNAiso Plus，靜置5 min；吸至1.5 mL的離心管；加入RNAiso Plus 1/5體積量的氯仿，劇烈振蕩15 s，靜置15 min；4 ℃、 12 000 r/min離心15 min；吸取上層水相轉移至新的1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇，靜置10 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入75%的乙醇1 mL，4 ℃、12 000 r/min離心5 min去乙醇；用RNAase-free溶解RNA，測定濃度，-80 ℃ 保存。 microRNA特異性反轉錄：10 μL 2 × miRNA Reaction Buffer Mix、2 μL 0.1% BSA、2 μL miRNA PrimeScript Enzyme Mix、1 μL Total RNA和5 μL RNase-Free H2O混合進行特異性反轉錄?；蚍崔D錄依照說明書操作。反應條件為95 ℃ 60 min；85 ℃ 5 s。實時定量PCR分析：microRNA的反應以U6為內參，反應條件為95 ℃ 10 min；40個循環(huán)(95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s)；溶解曲線設置為55 ℃到95 ℃。BDNF基因以β-actin為內參，反應條件為95 ℃ 10 min；40個循環(huán) (95 ℃ 5 s；60℃ 30 s；72℃ 15 s)；溶解曲線設置為55 ℃到95 ℃。實時定量引物見表2。

表1 BDNF基因 3 'UTR克隆的引物信息

表2 實時定量PCR的引物信息

1.3.5 熒光素酶活性檢測 GCs細胞轉染24 h后，吸去培養(yǎng)基，用PBS清洗，加入100 μL 1×Passive Lysis Buffer，室溫搖床上孵育15 min充分裂解細胞；吸取細胞裂解液至酶標板，分別先后加入100 μL熒光素酶測試試劑Ⅱ (LARⅡ)和 Stop&Glo試劑，并立即檢測海腎熒光素酶的活性，測量時，使用1～2 s延遲和5～10 s讀數(shù)。海腎熒光與螢火蟲熒光比值即為相對熒光素酶活性。

1.3.5 顆粒細胞活性試驗(MTT) 將GCs以1×105的接種量接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)液，轉染時的細胞密度達到50%。轉染miRNA的培養(yǎng)板里第1組為空白對照，第2～6組轉染miR-10b mimics，濃度分別為10、30、50和100 nmol/L，轉染BDNF因子的培養(yǎng)板里第1組為空白對照，第2～6組培養(yǎng)液中分別添加BDNF因子濃度為10、20、40、60 μg/L的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h處理細胞，并檢測吸光值。每孔加MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后終止培養(yǎng)，吸去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min使結晶物充分溶解，在490 nm波長處測定吸光值。計算公式：相對細胞活性=(轉染組OD值/空白對照組OD值)×100%。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0對數(shù)據進行分析，結果用平均數(shù)±標準差表示。單因素方差分析不同處理組的差異(BDNFmRNA的表達量，miR-10b表達量，熒光素酶表達量，細胞活性率)，t檢驗，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 miR-10b的差異表達

2.2 miRNA靶基因生物信息學預測結果與BDNF 3'UTR的 RCR擴增

隨機選取3組擴增得到的樣品，進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示，擴增條帶清晰，大小符合目的片段。將測序結果進行Blast比對，比對結果表明克隆正確。

圖1 miR-10b在多羔和單羔奶山羊卵巢組織中的差異表達
*P<0.05,**P<0.01。下圖同

Fig.1 Differential expression of miR-10b in polytocous and monotocous dairy goats
*P<0.05，**P<0.01.The same below

圖2 BDNF基因3'UTR區(qū)PCR擴增結果1～3. PCR產物；M. MarkerⅠ

2.3 pGL3-BDNF 3'UTR載體酶切鑒定結果

將重組載體進行酶切鑒定，得到兩個片段，其中小片段大小為257 bp，符合預期結果，而對照組單酶切結果只有一個片段(圖3)。重組載體測序結果進行Blast比對，結果說明載體構建成功。

2.4 熒光素酶活性檢測

經過SPSS軟件分析可知，共轉染pGL3-BDNF

3'UTR和miR-10b mimics，熒光素酶相對表達量極顯著低于空白對照組，轉染pGL3-BDNF 3'UTR和miR-10b mimics control，熒光素酶表達量與空白對照沒有顯著差異(圖4)，結果說明miR-10b可能作用于重組載體3'UTR區(qū)，即miR-10b作用于靶基因BDNF的3'UTR，導致熒光素酶表達量顯著下降。初步確定BDNF為miR-10b的靶基因。

圖3重組載體酶切鑒定
1.對照；2.重組載體；M1.DNA Marker Ⅲ；M2.250 bp Ladder

Fig.3 Enzyme digestion analysis on the recombination vector
1. Control;2. Recombination vector;M1. DNA Marker Ⅲ; M2. 250 bp Ladder

圖4熒光素酶相對表達量

Fig.4 Relative expression of luciferase

2.5 實時定量PCR檢測靶基因mRNA表達水平

實時定量PCR結果顯示，轉染miR-10b mimics后在顆粒細胞中檢測到miR-10b表達量是對照組的約40倍，說明顆粒細胞中miR-10b表達水平很高(圖5a)；由圖5b可見, 轉染miR-10b mimics后BDNFmRNA表達量及顯著低于對照組(P<0.01)。由此可以說明，高水平的miR-10b抑制了BDNF的表達，可能是通過降解BDNFmRNA而實現(xiàn)該過程。

2.6 miR-10b對顆粒細胞活性的影響

向顆粒細胞中轉染miR-10b mimics后細胞的相對活性見圖6。培養(yǎng)24 h后，miR-10b mimics處理組與對照組細胞相對活性沒有顯著變化；培養(yǎng)48 和72 h后，所有50、100 nmol/L處理組細胞的相對活性極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)低于對照組。過表達miR-10b可以抑制顆粒細胞的活性，轉染濃度為100 nmol/L。

圖5 實時定量PCR結果a. miR-10b的相對表達量；b. BDNF的相對表達量

圖6 miR-10b對顆粒細胞活性的影響A. Control; B, C, D, E.10, 30, 50, 100 nmol/L

2.7 BDNF因子對顆粒細胞活性的影響

由圖7知，培養(yǎng)24 h后，20 μg/L以上BDNF因子處理組細胞的相對活性顯著高于對照組(P<0.05)；培養(yǎng)48 h后，所有BDNF因子處理組細胞的相對活性均顯著高于對照組(P<0.05)；培養(yǎng)72 h后，BDNF因子處理組與對照組相比沒有顯著變化(P>0.05)。

2.8 BDNF因子和miR-10b對顆粒細胞活性的影響

根據前兩個試驗結果，加入外源性BDNF因子(20 μg/L)的同時轉染miR-10b mimics(100 nM)，分別在24 h、48 h和72 h后測定吸光值，計算細胞的相對活性。由圖8可知，培養(yǎng)24 h和48 h后，BDNF因子處理組細胞的相對活性顯著高于對照組(P<0.05)，而高水平的miR-10b抵消了BDNF因子對顆粒細胞活性的促進作用；培養(yǎng)72 h后，BDNF處理組細胞的相對活性與對照組相比沒有顯著提高，說明BDNF對顆粒細胞活性的促進有時間效應。以上結果表明，高水平的miR-10b可抑制BDNF促進顆粒細胞活性的作用，結合實時定量PCR結果可知，miR-10b可能通過調節(jié)BDNF基因的表達抑制顆粒細胞的活性。

圖7 BDNF因子對顆粒細胞活性的影響A. Control; B, C, D, E. 10, 20, 40, 60 μg/L

圖8 顆粒細胞的相對活性A. Control; B. miR-10b; C.BNDF; D. BNDF+miR-10b

3 討 論

顆粒細胞的增殖、分化是卵泡發(fā)育中的一項重要過程，卵巢發(fā)育關鍵基因促卵泡素受體(Follicle Stimulating Hormone Receptor，F(xiàn)SHR)就是在顆粒細胞中表達的[18]。顆粒細胞還能合成很多活性肽，如抑制素(Inhibin)[19]、激活素(activin)[20]、卵泡抑素(follistatin)[21]，這些蛋白不僅可以調節(jié)FSH的釋放，還可以作為調節(jié)因子直接參與卵泡發(fā)育過程。在排卵過程中，顆粒細胞可以介導調節(jié)促黃體生成素(LH)的分泌，從而調控排卵過程[22]。在卵泡閉鎖現(xiàn)象出現(xiàn)時，顆粒細胞也承擔著必不可少的作用。有學者發(fā)現(xiàn)，顆粒細胞的凋亡可以直接導致卵泡閉鎖[23]。如果發(fā)育中的卵泡周圍的顆粒細胞有10%以上出現(xiàn)了凋亡，那么這個卵泡可能正在或者已經閉鎖，而卵泡發(fā)生閉鎖之后，就不能正常發(fā)育。

顆粒細胞與卵泡發(fā)育有著緊密的聯(lián)系。然而，顆粒細胞究竟如何調節(jié)卵泡發(fā)育的機制還不是很清楚，仍需要學者們去研究探索。所以，研究顆粒細胞活性的調控機理，對促進卵泡發(fā)育、抑制卵泡閉鎖等生物學過程具有重要意義。很多研究證明神經生長因子家族成員能夠調節(jié)卵巢和生殖細胞的發(fā)育，如促進卵泡顆粒細胞的活性，加快初級卵泡的發(fā)育，促進初級卵泡中顆粒細胞的擴散等[24]。越來越多的研究證明，BDNF在生殖系統(tǒng)中具有重要作用。Dissen等[16]證實，BDNF有助于卵泡的發(fā)育，如促進卵泡顆粒細胞的活性以及原始卵泡的生長。BDNF及其受體TrkB可能作為聯(lián)系卵泡形成時卵母細胞與卵泡顆粒細胞的一種信號分子。Ojeda等[17]首次證明了BDNF及其受體TrkB表達于人初級卵泡和次級卵泡的顆粒細胞中，推測BDNF及其受體TrkB在人卵泡發(fā)育早期就參與了卵泡發(fā)育的調控。Harel[25]研究發(fā)現(xiàn)，BDNF和TrkB在人卵母細胞和卵丘細胞都有表達，說明BDNF可能通過調節(jié)卵巢內顆粒細胞和卵母細胞的生長、分化以及細胞間的相互作用而影響早期卵泡的發(fā)育的。目前很多研究者主要研究miR-10b在腫瘤組織或癌細胞中的功能作用，有關miR-10b參與調控卵巢細胞活性的報道非常少。本試驗初次研究miR-10b及其靶基因BDNF在卵巢顆粒細胞中的表達以及對體外培養(yǎng)的顆粒細胞活性的調控作用。

易康樂等[26]用BDNF因子處理體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細胞發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中加入20 μg/L的BDNF因子可顯著促進顆粒細胞增殖。本試驗中觀察到，在培養(yǎng)液中添加適宜濃度(20μg/L、40μg/L和60μg/L)的BDNF因子可以促進奶山羊卵巢顆粒細胞的活性，表明BDNF是重要的卵泡調節(jié)因子。然而，過表達miR-10b則會抑制顆粒細胞活性，表明miR-10b也具有重要的卵泡調節(jié)作用。在培養(yǎng)液中添加適宜濃度的BDNF因子的同時過表達miR-10b，顆粒細胞活性沒有明顯的變化，結合miR-10b靶基因驗證結果，推測高水平的miR-10b抑制了BDNF因子對顆粒細胞活性的促進作用。

本研究結果顯示，miR-10b是通過抑制BDNF基因的表達實現(xiàn)對卵巢顆粒細胞活性的抑制作用，與易康樂等[26]研究結果相符，而miR-10b作為調節(jié)BDNF基因的重要分子為研究奶山羊育種提供了新思路。本試驗結果為進一步研究miR-10b在卵泡發(fā)育中的功能和作用機理提供了試驗依據，對于提高奶山羊的產羔率具有重要意義。

4 結 論

miR-10b在單羔奶山羊卵巢組織中的相對表達量顯著高于多羔奶山羊卵巢組織中的相對表達量。熒光素酶報告載體和實時定量PCR驗證BDNF是miR-10b的靶基因。通過添加外源性BDNF因子可顯著促進卵巢顆粒細胞的活性，而高水平的miR-10b則顯著抑制了BDNF因子對顆粒細胞活性的促進作用。