饅頭色澤與質(zhì)構(gòu)性狀的GWAS分析

吳 澎 劉 娟 陳廣鳳 趙子彤楊 藝 李向陽(yáng) 唐曉珍 田紀(jì)春

(山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，泰安 271018)(德州學(xué)院生態(tài)與景觀學(xué)院2，德州 253023)(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥品質(zhì)育種研究室；山東省作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，泰安 271018)

饅頭是我國(guó)北方人民的主要面制食品，其消費(fèi)量占全國(guó)面制品消費(fèi)量的一半，在人們膳食結(jié)構(gòu)中占有非常重要的地位[1]。饅頭的質(zhì)構(gòu)與色澤性狀作為影響?zhàn)z頭品質(zhì)的兩個(gè)非常重要的因素，一直被看做評(píng)價(jià)饅頭質(zhì)量好壞的指標(biāo)。目前，國(guó)內(nèi)雖已有許多有關(guān)饅頭質(zhì)構(gòu)性狀與色澤性狀的研究[2-5]，但相較于國(guó)外學(xué)者對(duì)面包品質(zhì)從遺傳機(jī)理到加工過(guò)程都進(jìn)行大量深入細(xì)致的系統(tǒng)研究，并應(yīng)用到栽培及加工實(shí)踐的現(xiàn)狀，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)饅頭的研究深度較小，且多數(shù)局限于原料、配料和工藝條件對(duì)饅頭品質(zhì)的影響[6-10]，對(duì)饅頭品質(zhì)遺傳機(jī)理方面的研究幾乎是空白。隨著近幾年分子標(biāo)記在小麥等植物育種中的1成功運(yùn)用[11-16]，從分子角度對(duì)影響?zhàn)z頭各性狀的基因進(jìn)行分析成為研究熱點(diǎn)。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)是近年來(lái)在植物育種中應(yīng)用比較廣泛的分析技術(shù)，它是基于連鎖不平衡原理對(duì)目標(biāo)性狀與遺傳標(biāo)記或候選基因進(jìn)行分析，從而準(zhǔn)確定位與目標(biāo)性狀相關(guān)的基因位點(diǎn)[17-18]。與基因重組分析方法比較，關(guān)聯(lián)分析具有高通量、檢測(cè)速度快、精度高的特點(diǎn)，已經(jīng)成功應(yīng)用于玉米[20]、水稻[21]、擬南芥[22]、油菜[23]、大麥[24]等重要作物。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)標(biāo)記作為新型的第三代分子標(biāo)記，與傳統(tǒng)分子標(biāo)記相比SNP具有數(shù)量多、分布廣和密度高的特點(diǎn)，能在待測(cè)基因的附近和內(nèi)部提供一系列標(biāo)記，可極大的提高關(guān)聯(lián)分析的統(tǒng)計(jì)效力[25-26]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析對(duì)影響?zhàn)z頭質(zhì)構(gòu)與色澤性狀的基因位點(diǎn)進(jìn)行研究，旨在從分子層面比較饅頭感官性狀間的差別，為下一步結(jié)合小麥分子育種篩選優(yōu)良饅頭小麥品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及表型鑒定

實(shí)驗(yàn)群體由來(lái)自不同國(guó)家和省份的205份小麥品種構(gòu)成，包括55個(gè)骨干親本和73個(gè)高代品系。其中203份來(lái)自于我國(guó)種植冬小麥的10個(gè)省份，2份分別來(lái)自于法國(guó)跟墨西哥(見(jiàn)表1)。

表1 供試小麥材料

在2014年和2015年間，分別將供試小麥種植于山東德州實(shí)驗(yàn)點(diǎn)(德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院)和山東泰安實(shí)驗(yàn)點(diǎn)(山東農(nóng)業(yè)大學(xué))，每份小麥品種播種3行，行長(zhǎng)2 m，行與行之間間隔25 cm，重復(fù)2次。小麥生長(zhǎng)期間，對(duì)試驗(yàn)田進(jìn)行常規(guī)管理，沒(méi)有出現(xiàn)嚴(yán)重的病蟲害和倒伏現(xiàn)象。待小麥成熟后，將其收割、編號(hào)，研磨成面粉，并按傳統(tǒng)方法制作成饅頭。

待饅頭冷卻后，平放于桌面上，取每個(gè)饅頭外表皮的表面頂端為外表面色澤測(cè)量點(diǎn)，選取的外表面測(cè)量點(diǎn)要求平整光滑，以確保所測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。用色差儀測(cè)量其L*、a*、b*值，重復(fù)3次。測(cè)量結(jié)束后，用切割機(jī)將饅頭平行切割成三片，取中間片的內(nèi)瓤中間位置作為內(nèi)表面測(cè)量點(diǎn)，測(cè)量其L*、a*、b*值，重復(fù)3次。測(cè)量結(jié)束后，取饅頭中間片置于質(zhì)構(gòu)儀上，在TPA模式下采用P35探頭進(jìn)行壓縮實(shí)驗(yàn)[27]，測(cè)試前速率3.00 mm/s，測(cè)試速率1.0 mm/s，測(cè)試后速率1.0 mm/s，下壓程度50%。第一次壓縮結(jié)束后，探頭回到起始位置，等待3 s后進(jìn)行第二次壓縮。采用SPSS18.0軟件對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2 DNA提取和90 K SNP 芯片分型

依照稍作修改的Triticarte方法從小麥幼葉中提取DNA，并用0.8%的瓊脂糖電泳對(duì)提取DNA的濃度與質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。委托加利弗尼亞大學(xué)生物技術(shù)檢測(cè)中心，利用最新開(kāi)發(fā)的90K SNP基因芯片對(duì)群體DNA進(jìn)行分型，通過(guò)GenomeStudio軟件讀取分型結(jié)果并保存。同時(shí)，為確保獲得的基因數(shù)據(jù)的質(zhì)量，用PLINK v1.07[28]對(duì)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，去除檢出率小于0.8和低頻基因頻率小于0.05的標(biāo)記，最終得到24 355個(gè)標(biāo)記用于饅頭色澤和質(zhì)構(gòu)關(guān)聯(lián)分析。

1.3 性狀和標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析

運(yùn)用TASSEL 3.0 軟件中的MLM模型分別對(duì)目標(biāo)性狀(色澤、質(zhì)構(gòu))與標(biāo)記之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果中關(guān)聯(lián)標(biāo)記的P<0.001時(shí)，表明該標(biāo)記與目標(biāo)性狀存在顯著關(guān)聯(lián)；P<0.000 1時(shí)，表明該標(biāo)記與目標(biāo)性狀存在極顯著關(guān)聯(lián)。當(dāng)標(biāo)記在2個(gè)及以上環(huán)境中同時(shí)被檢測(cè)到則認(rèn)為其是目標(biāo)性狀相對(duì)穩(wěn)定的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色澤與質(zhì)構(gòu)性狀表型變異比較分析

饅頭色澤的6個(gè)相關(guān)性狀與質(zhì)構(gòu)的7個(gè)相關(guān)性狀在群體中的表型數(shù)據(jù)分別如表2和表3所示。四個(gè)環(huán)境中，各性狀的變異系數(shù)表現(xiàn)不同，色澤相關(guān)性狀中E1環(huán)境內(nèi)表面a*值變異系數(shù)最大(71.73%)，E4環(huán)境外表面L*變異系數(shù)最小(3.70%)；而質(zhì)構(gòu)相關(guān)性狀中E1環(huán)境黏著性變異系數(shù)最大(58.50%)，彈性變異系數(shù)最小(3.21%)。并且，色澤與質(zhì)構(gòu)相關(guān)性狀的峰度與偏度絕對(duì)值大部分都小于1，基本符合正態(tài)分布，屬于數(shù)量性狀遺傳，適合進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

表2 四個(gè)環(huán)境下饅頭色澤相關(guān)性狀在群體中的表型數(shù)據(jù)

注： E1：2014年泰安點(diǎn)；E2：2014年德州點(diǎn)；E3：2015年泰安點(diǎn)；E4：2015年德州點(diǎn)；內(nèi)L*：內(nèi)色差L*值；內(nèi)a*：內(nèi)色差a*值；內(nèi)b*：內(nèi)色差b*值；外L*：外色差L*值；外a*：外色差a*值；外b*：外色差b*值。

表3 四個(gè)環(huán)境下饅頭質(zhì)構(gòu)相關(guān)性狀在群體中的表型數(shù)據(jù)

注：E1：2014年泰安點(diǎn)；E2：2014年德州點(diǎn)；E3：2015年泰安點(diǎn)；E4：2015年德州點(diǎn)。

2.2 色澤性狀的關(guān)聯(lián)分析

通過(guò)對(duì)性狀與標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析，在P<0.001水平(顯著水平)上，4個(gè)環(huán)境中共檢測(cè)到276個(gè)饅頭色澤性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，其中23個(gè)極顯著(P<0.000 1)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，9個(gè)相對(duì)穩(wěn)定(至少在2個(gè)環(huán)境中同時(shí)被檢測(cè)到)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，30個(gè)高遺傳貢獻(xiàn)率位點(diǎn)(R2>10%)，分布于小麥21條染色體中的13條(1A、1B、1D、2A、2B、3A、3B、4A、5B、6A、6D、7A 和7D)，單個(gè)位點(diǎn)表型變異貢獻(xiàn)率為7.00%～14.07%。位于7A染色體上的極顯著位點(diǎn)Kukri_c18677_823表現(xiàn)出最大的表型變異貢獻(xiàn)率，可解釋14.07%的表型變異，但只在E4環(huán)境中檢測(cè)到(見(jiàn)表4)。

表4 4個(gè)環(huán)境中與饅頭色澤相關(guān)性狀極顯著 (P<0.000 1)、高貢獻(xiàn)率和穩(wěn)定位點(diǎn)

2.3 質(zhì)構(gòu)性狀多效性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)

在與饅頭質(zhì)構(gòu)性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)中(P<0.001)，同時(shí)與2個(gè)及2個(gè)以上性狀存在關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)被稱為多效性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)(表5)。23個(gè)控制饅頭質(zhì)構(gòu)相關(guān)性狀多效性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)及貢獻(xiàn)率見(jiàn)表5。其中，染色體2D上位點(diǎn)Kukri_c13329_800和7A染色體上位點(diǎn)wsnpcEx_c14654_22713386與咀嚼性、黏聚性、硬度、回復(fù)性4個(gè)性狀同時(shí)關(guān)聯(lián)，染色體2B上位點(diǎn)Tdurum_contig14707_251與咀嚼性、硬度、膠著性3個(gè)性狀同時(shí)關(guān)聯(lián)，與3個(gè)性狀同時(shí)關(guān)聯(lián)的還有染色體4B上位點(diǎn)Tdurum_contig4974_355和染色體7D上位點(diǎn)D_contig06359contig118，其余18個(gè)位點(diǎn)分別同時(shí)控制質(zhì)構(gòu)相關(guān)性狀的2個(gè)性狀。

3 討論

饅頭的色澤與質(zhì)構(gòu)性狀是衡量饅頭品質(zhì)優(yōu)良的重要指標(biāo)之一，不同的小麥品種及環(huán)境都會(huì)對(duì)成品的表型有一定的影響。本研究得到6個(gè)色澤相關(guān)性狀，7個(gè)質(zhì)構(gòu)相關(guān)性狀在4個(gè)不同環(huán)境下的表型數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)表明各性狀均表現(xiàn)出不同的變異系數(shù)，外表面a*值、內(nèi)表面a*值、硬度、黏著性、膠著感和咀嚼性6個(gè)性狀的遺傳變異系數(shù)大于20%，表明其遺傳變異豐富，相較于其余性狀，這6個(gè)性狀具有較大的改良潛力。遺傳變異系數(shù)處于10%～20%之間的性狀有外表面b*、內(nèi)表面b*、回復(fù)性3個(gè)性狀。本實(shí)驗(yàn)群體在以上性狀具有比較豐富的遺傳變異，表明利用冬小麥資源對(duì)饅頭色澤、質(zhì)構(gòu)性狀改良具有較大的潛力。

本研究利用24 355個(gè)SNP位點(diǎn)以及MLM模型對(duì)饅頭質(zhì)構(gòu)與色澤性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在顯著水平下檢測(cè)到較多的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。一方面說(shuō)明了檢測(cè)位點(diǎn)較為全面，另一方面也表明了該實(shí)驗(yàn)群體的遺傳變異較為豐富。環(huán)境因素對(duì)作物基因的表達(dá)有重要的影響，關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的表達(dá)分為兩類，一類為環(huán)境間特異性表達(dá)，另一類為多種環(huán)境下穩(wěn)定表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)不同環(huán)境E1、E2、E3、E4，并將在兩個(gè)及以上環(huán)境中表達(dá)的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)定義為相對(duì)穩(wěn)定的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。通常，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果中顯著性較大的位點(diǎn)與性狀的關(guān)聯(lián)度較高，假陽(yáng)性的概率低，因此，本實(shí)驗(yàn)將顯著性較大的位點(diǎn)(P<0.000 1)定義為極顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。相對(duì)穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與極顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)都對(duì)研究饅頭質(zhì)構(gòu)性狀有較大的意義，因?yàn)榛蛭稽c(diǎn)的研究目的是將所得性狀位點(diǎn)信息最終應(yīng)用于分子輔助育種上。

表5 饅頭質(zhì)構(gòu)多效性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)

4 結(jié)論

利用分布于小麥全基因組的24 355個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)205份不同小麥粉饅頭的色澤和質(zhì)構(gòu)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。檢測(cè)到276個(gè)饅頭色澤性狀顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，其中23個(gè)極顯著(P<0.000 1)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，9個(gè)相對(duì)穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，30個(gè)高遺傳貢獻(xiàn)率位點(diǎn)(R2>10%)，分布于小麥的13條染色體。檢測(cè)到23個(gè)與饅頭質(zhì)構(gòu)性狀存在顯著關(guān)聯(lián)的多效性位點(diǎn)，分布于小麥的15條染色體。這些關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與多效性位點(diǎn)的獲得，有助于從分子層面理解饅頭感官性狀間的差別，并可進(jìn)一步結(jié)合分子育種技術(shù)改良饅頭用小麥品種。