利用KASP標記評價水稻品種多態(tài)性

程萌杰，閆雙勇，施利利,3，孫寧，張欣,3，丁得亮,3，邊嘉賓,3,通信作者，王松文,3,通信作者

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利用KASP標記評價水稻品種多態(tài)性

程萌杰1，閆雙勇2，施利利1,3，孫寧1，張欣1,3，丁得亮1,3，邊嘉賓1,3,通信作者，王松文1,3,通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384；2. 天津市水稻研究所，天津 300384；3. 天津中日水稻品質(zhì)食味研究中心，天津 300384）

采用600個KASP標記對51個品種進行多態(tài)性評價。結(jié)果表明：373個標記可以準確判定種質(zhì)的單倍型，制定DNA指紋圖譜，鑒定染色體片段代換系，其中有兩個染色體片段代換系分別攜帶基因和基因。由51個品種構(gòu)成一個自然群體，其多樣性為568.50，粳型雜交稻保持系341B與HC-66（秈稻）的多態(tài)性為0.82，‘341B’與‘IPM’（秈稻）的多態(tài)性為0.80。373個標記可用于設(shè)計育種與模塊育種。

水稻；KASP標記；多態(tài)性；染色體片段代換系

水稻是最重要的糧食作物之一。1992年，美國、日本、中國幾乎同時啟動了水稻基因組計劃（Rice Genome Program，RGP），其基本策略是解析水稻（）的基因組結(jié)構(gòu)，在保持水稻高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的基礎(chǔ)上改良新品種。美國RGP率先繪制了遺傳圖[1]，發(fā)展了SSR（Simple Sequence Repeat）標記[2]，利用圖位克隆法克隆了水稻抗白葉枯病基因[3]。日本學(xué)者制備了遺傳圖、物理圖、轉(zhuǎn)錄圖、序列圖[4-5]。中國RGP在早期就注重RGP成果的應(yīng)用，克隆了數(shù)百個重要農(nóng)藝性狀基因，啟動了分子育種國家計劃[6-7]。

分子育種主要包括分子標記育種與基因工程育種[8]。在我國，第一代標記（RFLP）、第二代標記（SSR）、第三代標記（SNP）技術(shù)的跟蹤和創(chuàng)新步伐加快，在一些實驗室和育種研究所都取得了突破性進展。

KASP（Kompetitive Allele Specific PCR）是競爭性等位基因特異性PCR的縮寫，可在廣泛的基因組DNA樣品中（甚至是一些復(fù)雜基因組DNA樣品），對SNPs和特定位點上的InDels進行精準等位基因判斷。KASP一出現(xiàn)，就在小麥、西紅柿等作物上得到應(yīng)用[9]。本研究中利用KASP標記對選育的新品種及參照品種進行評價，以期了解水稻基因組的結(jié)構(gòu)[10]，為塑造親本、選育新組合奠定基礎(chǔ)[11]。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料如表1所示。

表 1 試驗材料

其中，‘日本晴’從日本先端技術(shù)研究所引進，‘沈農(nóng)15’由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)選育，‘越優(yōu)16’‘C418’‘早恢16’‘廣占63S’由遼寧農(nóng)科院選育，‘341B’‘C602’由天津農(nóng)科院選育，‘津原85’‘218S’由天津原種場選育，‘中花11’由北京市農(nóng)林科學(xué)院選育，‘58025’由國際水稻所選育，‘廣陸矮4號’由廣東農(nóng)科院選育。

試驗材料在國家水稻基因組計劃構(gòu)建作圖群體材料的基礎(chǔ)上進行擴建，參照國際微型種質(zhì)資源庫構(gòu)建原則，即最少的材料代表盡量多的遺傳多樣性。其中，部分材料進行了前期基因聚合，如‘黑419’是以‘華占’為母本、‘廣西野生稻（GX102）’為父本進行雜交，連續(xù)回交11代選育出的重組自交系。

1.2 方法

依據(jù)KASP原理，設(shè)計正向引物和反向引物，假定兩個正向引物具有同樣的競爭能力，在PCR產(chǎn)物中存在兩種等量的成分。本研究設(shè)計了600個KASP標記，采用LGC? SNPline 基因型分型技術(shù)平臺進行PCR擴增、熒光標記、基因分型、數(shù)據(jù)處理，獲得基因型后，采用最小距離法聚類并繪制圖示基因型[12]。

以‘揚稻6號（9311）’為基因供體，分別與不同品種進行雜交，并回交3代或4代，選擇攜帶‘揚稻6號’的染色體片段代換系，這些代換系分為秈稻（回交親本）或粳稻（回交親本），利用373個KASP標記鑒定，91個染色體片段代換系，可以攜帶‘揚稻6號’的全部基因組，參照邊建民[13]方法繪制染色體片段代換系群的遺傳圖譜。

使用SPSS軟件得到相似數(shù)據(jù)矩陣和遺傳距離矩陣。計算群體多樣性時，以一個品種作為公共親本，計算與其他50個品種的多樣性系數(shù)（品種多樣性），將這50個多樣性系數(shù)加權(quán)平均，然后累加各品種的加權(quán)平均值獲得群體多樣性系數(shù)（群體多樣性）。

2 結(jié)果與分析

2.1 圖示基因型

首先對600個KASP標記進行鑒定，依據(jù)多態(tài)性、品種鑒定能力、標記的育種學(xué)信息等，選取373個多態(tài)性高的標記，其相應(yīng)的基因型組成了一組遺傳信息矩陣。其中，第1染色體的圖示基因型如圖1。

圖1 第1染色體的圖示基因型

圖1表明，粳稻的多態(tài)性低，秈稻多態(tài)性高，基因組中的雜合位點可以清楚地顯示（圖中黑色部分）。在本研究中，有的染色體片段較大，樣本32的雜合區(qū)域覆蓋了10個標記，有的雜合區(qū)段被分割成多個小段，樣本36被分割（通過互換重組）成若干小的雜合片段，還有些具有親緣關(guān)系的不同品種表現(xiàn)為具有相同的雜合片段，如樣本17、18、19、20出現(xiàn)了8個相同的標記（基因型）。

2.2 染色體片段代換系

由于基因組中的標記已經(jīng)比較飽和，600個標記可以準確地鑒定染色體片段代換系。染色體片段代換系如圖2。

圖2 染色體片段代換系圖譜

圖2表明，一個染色體片段攜帶高產(chǎn)基因表現(xiàn)為穗粒數(shù)增加，單株產(chǎn)量提高；另一個代換片段表現(xiàn)為長粒型，110個染色體片段代換系攜帶了粳稻品種‘日本晴’的完整基因組。第1 染色體最大，均勻分布了39個KASP標記（圖1），其中，攜帶的一個染色體片段代換系覆蓋了10個KASP標記的大片段。在育種上，可用于穗粒數(shù)、產(chǎn)量等多個性狀的改良；在遺傳上，可用于這個雜合區(qū)域的染色體定位及基因克隆的研究。同時，該染色體片段代換系還可用于基于改良強化回交的育種程序，實施定向育種研究。

2.3 51個品種的遺傳多樣性

51個品種構(gòu)成了一個自然群體，這個群體也是一個育種群體，由28個骨干系（基因受體）和23個參照系（基因供體）構(gòu)成，某些自然品種，如‘T95’‘巴西稻006’保持了未雜交品種的原始位點基因型（稀有位點基因型），一些新育成品種，如‘早恢16’‘9311Y’‘偉 27’聚合了大量的高產(chǎn)基因，往往能夠產(chǎn)生很強的雜種優(yōu)勢。51個品種的遺傳多樣性見表2。

表2 51個品種的遺傳多樣性

表2表明，某些品種的多樣性豐富，一方面典型的粳稻與典型的秈稻之間表現(xiàn)為很高的多態(tài)性，如‘341B’‘C602’多態(tài)性分別為0.58、0.60，主要是由于秈稻品種和粳稻品種的選擇使它們成為了極端類型。另一方面，一些粳稻在改良成粳型恢復(fù)系的過程中，引入了大量的秈稻成分。在秈稻中，表現(xiàn)為秈稻亞種內(nèi)的多態(tài)性高，如樣品13（康黑種子）、樣品15（U-1）引入了野生稻成分，樣品11（Y900 F4）集中了不同秈稻品種的多態(tài)性。樣品47（9311Y）遺傳多樣性表現(xiàn)并不突出，但性狀多型性突出，可能是基因進化（遺傳進化）與性狀進化不同步，其機制有待進一步研究。

3 討論

3.1 水稻品種的遺傳多樣性

Morishima等根據(jù)形態(tài)性狀和同工酶估算，秈粳分化占遺傳多態(tài)性的50%[14]。Zhang等分析，典型的秈稻和粳稻品種之間的多態(tài)性約為34%[15]。本研究中采用KASP標記對課題組選育的品種及參照品種進行多態(tài)性評估，群體多樣性指數(shù)為568.50，有些品種的多樣性指數(shù)可達0.60（‘中花 11’），粳型雜交稻保持系‘341B’與秈稻表現(xiàn)了最高的多態(tài)性，‘341B’與‘HC-66’（秈稻）的多態(tài)性為0.82，‘341B’與‘IPM’（秈稻）的多態(tài)性為0.80。從基因作圖群體標準分析，基因作圖群體要求多態(tài)性高、育性正常及偏分離少?！?41B’可能是基因作圖的一個良好親本，其F1育性、F2基因位點偏分離比例等有待進一步分析。從雜交稻育種的優(yōu)勢表現(xiàn)和作為骨干系的育種效應(yīng)看，‘341B’是一個良好的保持系，其同核異質(zhì)系‘341A’同‘C418’配置的雜交稻‘3優(yōu)18’通過了國家新品種審定，表現(xiàn)為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)多抗的優(yōu)良特性。

3.2 KASP標記的檢測效能

KASP技術(shù)由英國LGC Genomics公司發(fā)明，用紅藍熒光標記紀錄兩個競爭性引物的信號，KASP技術(shù)的要點是SNP位點的兩側(cè)序列已知，3 000個水稻品種的重測序信息為KASP標記檢測提供了方便[16]。在小麥中實現(xiàn)了多位點KASP檢測，在西紅柿等作物中依據(jù)KASP標記進行了分子育種。在水稻中，本課題組與中玉基因標記合作，聯(lián)合建立了KASP檢測平臺，率先開展了51個育種骨干系的基因組分析和模塊分析。在現(xiàn)代育種體系中，高通量檢測往往采用SNP標記和基因芯片檢測，SNP檢測和基因芯片檢測有一些報道[17]，適于設(shè)計育種（Breeding by Design）[18]、作物定制改良（Crop Tailor-improve）[19]，而模塊育種（Module Breeding）KASP檢測尚未見報道。但是，高通量檢測、育種信息收集與利用[20]、核心親本的創(chuàng)制、性狀的遺傳與控制[21]、多功能整合的育種平臺建立等都是新時期育種的努力方向。

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責任編輯：宗淑萍

Evaluation of rice variety polymorphisms using KASP markers

CHENG Meng-jie1, YAN Shuang-yong2, SHI Li-li1,3, SUN Ning1, ZHANG Xin1,3, DING De-liang1,3, BIAN Jia-bin1,3,Corresponding Author, WANG Song-wen1,3,Corresponding Author

（1. College of Agronomy and Resource Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Rice Research Institute, Tianjin 300384, China; 3. China-Japan Joint Center on Palatability and Quality of Rice in Tianjin, Tianjin 300384, China）

Polymorphisms were evaluated in 51 varieties using 600 KASP markers. The results showed that 373 markers could accurately determine the haplotypes of the germplasm, develop DNA fingerprints, and identify chromosome fragment substitution lines, among which two chromosomal fragment substitution lines carry the NOG1 gene and the GS5 gene, respectively. A natural population consists of 51 varieties, with the diversity 568.50. The polymorphism of 341B and HC-66（indica）is 0.82, and the polymorphism of 341B and IPM（indica）is 0.80. 373 markers can be used for breeding by design and module breeding.

rice; KASP marker; polymorphism; chromosome fragment substitution system

1008-5394（2018）04-0013-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.04.004

S336

A

2018-09-18

天津市科技計劃項目（16ZXZYNC00110）

程萌杰（1993-），女，碩士在讀，主要從事水稻育種研究。E-mail：1191107941@qq.com。閆雙勇（1974-），男，副研究員，碩士，主要從事水稻育種研究。E-mail：niceone02@163.com。程萌杰和閆雙勇對本文具有同等貢獻，為并列第一作者。

邊嘉賓（1977-），男，副研究員，博士，主要從事水稻育種研究。E-mail：4295997@qq.com。王松文（1958-），男，教授，博士，主要從事水稻育種研究。E-mail：dw186001@aliyun.com。