球型脂聯(lián)素通過TGFβ1/Smads通路對2型糖尿病大鼠腎病保護作用的探討

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近年來，糖尿病(DM)患病率迅速增加。最新數據顯示，中國成年人DM患病率高達10.9%，DM前期患病率為35.7%[1]。糖尿病腎病(DN)是DM最嚴重的并發(fā)癥和導致終末期腎病(ESRD)的主要原因之一[2]。轉化生長因子-β1(TGF-β1)被認為是腎臟纖維化的關鍵介質，Smad依賴性信號通路是TGF-β1誘導纖維化的經典通路[3]，與DN發(fā)生發(fā)展密切相關。近年研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素(ADPN)可能具有抑制腎臟纖維化作用，但機制尚不完全清楚[4-5]。本研究觀察了球型脂聯(lián)素(gAd)對2型糖尿病大鼠腎臟病變TGF-β1/Smads通路的影響，旨在探討gAd對糖尿病腎臟病變的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級4周齡體重(180～200) g的健康SD雄性大鼠60只(山西醫(yī)科大學動物實驗中心)；高糖高脂飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)；鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)；gAd(美國BioVision公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模及分組 60只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為NC組(18只)、造模組(42只)。NC組喂養(yǎng)普通飼料，造模組喂養(yǎng)高糖高脂飼料。12周后大鼠平均體重達500 g，禁食12 h，給予造模組空腹一次性腹腔內注射1% STZ 30 mg/kg，NC組腹腔內注射等量緩沖液，72 h后尾靜脈取血測血糖≥16.7 mmol/L，同時出現(xiàn)DM癥狀，即2型糖尿病大鼠模型成功建立。繼續(xù)喂養(yǎng)6周檢測造模組大鼠尿蛋白陽性，腎臟病理示腎小球系膜細胞增生、基膜增厚，腎小球體積明顯增大，同時腎小管管腔變窄，表明2型糖尿病大鼠腎臟病變模型成功建立。最終成模36只，隨機分為DM組(18只)、AD組(18只)。AD組給予gAd腹腔緩慢注射10 μg/(kg·d)，余兩組予等量生理鹽水。

1.2.2 標本采集 于觀察4周、8周、12周末各組隨機取6只大鼠，收集24 h尿液，測24 h尿蛋白、尿肌酐。大鼠稱重，麻醉后從腹主動脈采血，離心取血清，于-80 ℃保存?zhèn)錅y；處死大鼠，切取左腎去被膜后長軸對切，稱重，濾紙吸干表面血液及水分，取部分用10%中性甲醛固定后石蠟包埋，剩余部分液氮凍透后-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 腎臟病理改變 10%中性甲醛固定腎組織，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片，厚3 μm，HE 染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學。

1.2.4 免疫組化 采用SABC 法測腎組織TGF-β1、Smad3、Smad7水平。圖像分析采用Scanscope 數字掃描系統(tǒng)，每張隨機選5 個不同鏡下視野內各指標的平均積分光密度，以棕黃色顆粒為陽性，陽性表達與灰度值成反比。

1.2.5 Real Time-PCR法 測定腎組織TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA表達。取各組腎臟組織50 mg提總RNA，反轉錄行Real Time-PCR擴增： 94 ℃預變性10 min，然后94℃變性15 s，60 ℃復性60 s，共45循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot法 測腎組織TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達。提取蛋白樣本，轉膜，封閉，1∶1 000稀釋鼠源 TGF-β1、Smad3、Smad7抗體(美國Cell Signaling公司)4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育 2 h，ECL底物化學發(fā)光顯色、顯影、定影、掃描。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況 DM 組較同期NC組大鼠空腹血糖(FBG)、24 h尿蛋白、尿肌酐、腎重/體重升高，AD組較同期DM組上述指標降低(P<0.05)。詳見表2 。

表2 各組大鼠一般特征比較比較(±s)

2.2 腎臟組織形態(tài)學改變 光鏡下，NC組腎臟結構清晰。DM組腎臟結構較NC組紊亂，腎小球肥大，內皮細胞紊亂，系膜細胞腫脹，系膜基質明顯增多，系膜區(qū)顯著擴大，腎小管細胞增生肥大，管腔變窄且可見空泡樣變。4周時上述改變即出現(xiàn)，8周、12周逐漸加重。AD組較DM組腎臟結構損害明顯減輕。詳見圖1。

圖1 光鏡下各組大鼠腎臟形態(tài)學變化(HE染色×200)

2.3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad7免疫組化改變 NC組大鼠腎小球、腎小管低TGF-β1、Smad3表達，Smad7高表達；然而，與NC組比，DM 組大鼠TGF-β1、Smad3表達明顯增加，Smad7表達明顯降低(P<0.05)；與DM組比，AD組TGF-β1、Smad3表達減少，Smad7表達增加(P<0.05)。詳見表3、圖2～圖4。

表3 各組大鼠腎臟 Smad3、Smad7、TGF-β1免疫組化灰度值比較(±s)

圖2 免疫組化示各組大鼠腎臟Smad3表達(×200)

圖3 免疫組化示各組大鼠腎臟Smad7表達(×200)

圖4免疫組化示各組大鼠腎臟TGF-β1表達(×200)

2.4 各組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA表達的變化 與同期NC組比，DM組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達增加，Smad7 mRNA表達減少(P<0.05)；AD組TGF-β1、Smad3 mRNA表達較DM組減少，Smad7 mRNA表達較DM組增加(P<0.05)，且于8周、12周時接近NC組水平。詳見表4。

表4 各組大鼠腎臟Smad3 mRNA、Smad7 mRNA、TGF-β1mRNA表達比較(±s)

2.5 各組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達的變化 各時間段中，DM組TGF-β1、Smad3蛋白水平較NC組增加(P<0.05)，AD組TGF-β1、Smad3蛋白水平較DM組減低(P<0.05)；相反，DM組Smad7蛋白水平較NC組減低(P<0.05)，而AD組Smad7蛋白水平較DM組增加(P<0.05)；上述指標于8周、12周時，AD組與同期NC組間表達無統(tǒng)計學意義。詳見表5、圖5。

表5 各組大鼠腎臟Smad3、Smad7、TGF-β1蛋白表達的比較(±s)

圖5 Western blot 檢測各組大鼠腎臟Smad3、Smad7、 TGF-β1蛋白表達

3 討 論

DN是DM最嚴重的并發(fā)癥之一，其病理變化主要表現(xiàn)為間質纖維化、腎小球硬化及腎小管萎縮[6]。腎纖維化是各種病因引起慢性腎臟疾病進展到ESRD的共同通路[7]。

TGF-β1是腎纖維化過程中重要的細胞因子[8-11]。Smad依賴性信號通路是TGF-β1誘導纖維化的最經典的信號通路[3]。Smads家族包含9種 Smad 蛋白，分三大亞型，依次是膜受體激活型 Smad(R-Smad)、通用型Smad(Co-Smad)和抑制型Smad(I-Smad)。Smad3為R-Smad的一種，當TGF-β與其位于胞膜的受體結合后，Smad3發(fā)生磷酸化，進而與Smad4(Co-Smad)形成復合物進入核內調節(jié)靶基因轉錄[12-13]。而Smad7為I-Smad，可競爭性地抑制R-Smad與受體結合，是TGF-β1信號通路的抑制因子。Smad3在高糖時被激活，而Smad7通過泛素-蛋白酶體降解機制被降解[14]。本實驗從組織病理、mRNA及蛋白水平均說明，DM組TGF-β1、Smad3表達升高，而Smad7表達降低，且平行于腎臟纖維化程度。提示TGF-β1、Smad3在2型糖尿病腎臟病變腎臟纖維化中起致病作用，Smad7起保護作用。

ADPN是主要由脂肪細胞分泌的脂肪因子[15]，由244個氨基酸組成，與膠原蛋白和TNF-α結構相似[16]，其中gAd是ADPN實現(xiàn)生物效應的主要區(qū)域。ADPN具有增加胰島素敏感性、抗炎及血管保護作用[17]。多項研究表明，ADPN亦可通過減少糖代謝終末產物，增強超氧化物歧化酶(SOD)活力，保護血管內皮、減輕活性氧的損害等方面發(fā)揮抗腎臟纖維化作用[18-20]。本實驗發(fā)現(xiàn)，不同時間段，DM 組較相應NC組大鼠FBG、24 h尿白蛋白、尿肌酐、腎重/體重明顯升高，腎臟結構紊亂。AD組較同期DM組上述指標明顯降低，腎臟結構損害減輕。AD組較同期DM組TGF-β1、Smad3表達減少，Smad7表達增加。說明gAd可通過TGF-β1/Smads通路，延緩糖尿病腎臟病變腎纖維化的進展。gAd干預4周時即可上調Smad7表達，同時下調TGF-β1、Smad3的表達，使TGF-β1、Smad3、Smad7的水平在gAd干預達8周、12周時與NC組無統(tǒng)計學意義，說明在gAd干預的早期(4周)即可表現(xiàn)出其對糖尿病腎臟病變的保護作用，隨著gAd作用時間的延長，這種保護作用更加明顯。

綜上所述，gAd可通過抑制TGF-β1/Smads，下調Smad3表達，同時上調Smad7表達，延緩2型糖尿病腎病腎臟纖維化的進展。