益氣強心飲干預(yù)慢性心力衰竭大鼠CaSR及心肌細(xì)胞凋亡的實驗研究

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慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是臨床的常見病及多發(fā)病，是多種心血管疾病的嚴(yán)重和終末階段[1]。隨著現(xiàn)今社會生活方式的改變和人口老齡化的日益加重，慢性心力衰竭的患病率和病死率也逐年升高。流行病學(xué)調(diào)查報告顯示，國外慢性心力衰竭的發(fā)病率隨年齡增加[2]，65歲以上人群可達(dá)10%，中國人群心力衰竭發(fā)病率為0.08%，老年心力衰竭發(fā)病率高于中青年人[3]。本課題從心力衰竭發(fā)病機制入手，探討如何防治慢性心力衰竭。目前研究表明細(xì)胞凋亡是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的重要機制[4]，有效的干預(yù)細(xì)胞凋亡，可以預(yù)防心室重構(gòu)，是防治慢性心力衰竭的一條全新途徑。而研究證實鈣敏感受體(Calcium-sensing receptor，CaSR)參與細(xì)胞凋亡[5-7]，如何在凋亡的早期阻斷CaSR途徑介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)，改善心功能，延緩或逆轉(zhuǎn)心力衰竭的發(fā)生發(fā)展，成為目前研究的重點課題。本課題組研究益氣強心飲干預(yù)慢性心力衰竭模型大鼠的鈣敏感受體激活及心肌細(xì)胞凋亡，以揭示中藥益氣強心飲治療及延緩心力衰竭發(fā)展的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇雄性Wistar大鼠80只，SPF級，(11±1)周齡，體重(200±20) g，實驗動物來源于遼寧長生生物科技有限公司，動物許可證號：SCXK(遼)2015-0001。所有大鼠以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實驗藥品 益氣強心飲由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院煎藥室制備，藥物組成為制附子、黃芪、葶藶子、澤蘭、丹參、紅花等?？ňS地洛片為北京巨能有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號：20150901；鹽酸貝那普利片為上海新亞藥業(yè)閔行公司，生產(chǎn)批號：150701。

1.3 實驗儀器及試劑 奧林巴斯BX51顯微鏡，由日本奧林巴斯生產(chǎn)；BCD-243KA超低溫冰箱，由美國生產(chǎn)；LKBV型超薄切片機，由瑞典生產(chǎn)；TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒，CaSR免疫組化試劑盒，CaSR抗體，細(xì)胞裂解液等購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。取材器械由上海醫(yī)療器械制造廠生產(chǎn)。

1.4 CHF大鼠模型的建立 根據(jù)文獻(xiàn)[8-9]，結(jié)合預(yù)實驗經(jīng)驗，采用腹主動脈縮窄改良術(shù)式建立 CHF大鼠模型，大鼠經(jīng)3.5%水合氯醛腹腔[1 mL/(100 g)]麻醉后，采用左側(cè)臥位，于右側(cè)髂腰區(qū)備皮，在右腎于右髂腰區(qū)的體表投影為中心，作一長(2～3) cm的縱向切口，鈍性分離皮膚、筋膜及肌肉，剪開右腎脂肪囊，輕輕牽拉右腎，暴露腎門背側(cè)，沿右腎動脈尋找右腎動脈與腹主動脈的分叉點，在分叉點上方2 mm處分離腹主動脈，然后用外科縫線將一根8號針頭與該段腹主動脈一起結(jié)扎，再將針頭抽出，造成結(jié)扎處腹主動脈內(nèi)徑縮窄。假手術(shù)組僅分離腹主動脈，但不予以結(jié)扎，然后依次還納各臟器，關(guān)腹，縫合切口。術(shù)后為預(yù)防感染，大鼠均予肌肉注射青霉素每只10 000 U，連續(xù)5 d。

在實驗大鼠腹主動脈結(jié)扎4周后，如大鼠出現(xiàn)呼吸急促、心動過速和勞力性呼吸困難等失代償性癥狀，同時完善心臟彩超檢測，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<50%，則CHF大鼠模型造模成功。

1.5 分組及給藥 80只大鼠隨機分為假手術(shù)組20只、手術(shù)組60只。按方法造模后，假手術(shù)組死亡2只大鼠，手術(shù)組死亡14只。篩選手術(shù)組中具有慢性心力衰竭典型表現(xiàn)的大鼠38只，隨機分為模型組12只，中藥組13只、西藥組13只，加上假手術(shù)組(n=18)，共4組。各組動物于同等條件下飼養(yǎng)，中藥組予益氣強心飲，用藥量為生藥22 g /(kg·d)；西醫(yī)組予卡維地洛6 mg/(kg·d)，貝那普利10 mg/(kg·d)，按1 mL/(100 g)灌服溶液，每日1次；假手術(shù)組與模型組灌服等量生理鹽水，每日1次，共8周。

1.6 指標(biāo)測定

1.6.1 大鼠心功能測定 各組大鼠在用藥前及用藥8周后均完善心臟超聲檢查。大鼠稱重后，腹腔注射氯胺酮(75 mg/kg)和地西泮(5 mg/kg)，仰臥位固定，胸部備皮，涂耦合劑。使用Vevo 2100 超聲儀MS-250心臟探頭，頻率(13～15)MHz，在左室內(nèi)徑最大處將M型取樣線垂直于室間隔和左心室后壁獲得M型超聲心動圖，連續(xù)3次測量左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDD)及收縮末期內(nèi)徑(LVIDS)，LVEF取其平均值。同時計算左室射血分?jǐn)?shù)及左心室短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS)。

1.6.2 TUNEL法測定大鼠心肌細(xì)胞凋亡的數(shù)量 光鏡下觀察正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，為陰性反應(yīng)。凋亡細(xì)胞核呈深淺不一的顆粒狀紅色，為陽性反應(yīng)。根據(jù)凋亡陽性細(xì)胞在400高倍鏡視野下的分布情況，每組標(biāo)本觀察5 張切片，每張切片拍攝5個陽性視野，每視野計數(shù)100個心肌細(xì)胞，記錄其中TUNEL陽性細(xì)胞總數(shù)，并以每100個細(xì)胞中的陽性數(shù)為凋亡指數(shù) (apoptotic index，AI)。

1.6.3 大鼠心肌CaSR的Western blot 檢測 實驗具體步驟按照CaSR的Western blot 檢測試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)操作。取0.1 g心肌組織低溫研磨后，加入蛋白裂解液，充分裂解后，4℃條件下離心15 min，取上清。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用Bradford法對所取上清進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白，進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，然后在100 V，時間1 h，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。該膜浸沒在Western blot封閉液中(TBST溶解的5%脫脂奶粉，pH7.4)，37 ℃封閉1 h，加入CaSR抗體(1∶2 000)中孵育過夜。TBST反復(fù)洗膜后，將膜與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗Ig抗體(1∶1 000)孵育，37 ℃輕搖1 h，再反復(fù)洗膜，之后用Western blue 顯跡，同時用β-actin抗體(1∶500)為內(nèi)參，用不加CaSR抗體作為陰性對照。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心功能測定 造模后與假手術(shù)組相比，手術(shù)組大鼠 LVEF 明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；手術(shù)組與假手術(shù)組相比，F(xiàn)S明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與假手術(shù)組相比，手術(shù)組 LVIDD升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組 E/A 值相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1、圖 1。

表1 兩組大鼠心功能超聲檢測結(jié)果(±s)

圖1 兩組大鼠心臟超聲結(jié)果

2.2 各組大鼠心肌組織CaSR蛋白的表達(dá)(見表2) 假手術(shù)組與其他各組比較，心肌細(xì)胞的CaSR蛋白含量較低， 有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；模型組與其他用藥組比較，心肌細(xì)胞CaSR蛋白含量較高有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但中藥組與西藥組相比無統(tǒng)計學(xué)意義，表明中藥組和西藥組心肌細(xì)胞CaSR蛋白含量相當(dāng)。從 CaSR電泳圖(見圖 2)可以看出，模型組的電泳條帶最寬，而假手術(shù)組最窄，中藥組和西藥組次之，GAPDH各組之間寬窄程度均一。

表2 各組CaSR 蛋白表達(dá)的比較(±s)

圖2 各組 CaSR 蛋白表達(dá)

2.3 各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡情況 在顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞核不被染色因而看不到，而經(jīng)TUNEL法染色后，凋亡的細(xì)胞核呈棕黃色。假手術(shù)組與其他各組比較，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)最低(P<0.05)；模型組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)最高，而中藥組和西藥組次之(P<0.05)；中藥組與西藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，兩組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)相當(dāng)。詳見表 3。

表3 各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(±s) %

3 討 論

目前心力衰竭的患病率和病死率呈現(xiàn)快速增長的趨勢[10-11]，《中國心血管病報告2016》中提到我國心血管病患病率及死亡率仍處于上升階段，推算我國的心力衰竭病人高達(dá) 450 萬人，慢性心力衰竭病人的平均發(fā)病年齡呈上升趨勢，為66歲±15歲，心血管病死亡率仍高居首位[12]，而心力衰竭是導(dǎo)致心臟病病人死亡的最主要原因，心力衰竭病人5年內(nèi)的死亡率為50%[13-14]。防治心力衰竭成了治療心血管疾病的重中之重。

如今慢性心力衰竭研究日益深入，早已從體液潴留、泵功能障礙學(xué)說過渡到現(xiàn)在的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)過度激活等導(dǎo)致的心室重構(gòu)學(xué)說，而心肌細(xì)胞凋亡就參與其中，是慢性心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的重要機制[15]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡，對細(xì)胞的生長和發(fā)育起著重要的作用[16]，心肌細(xì)胞凋亡時大量心肌細(xì)胞減少，心肌細(xì)胞減少會導(dǎo)致心臟泵功能喪失，而細(xì)胞凋亡后，在凋亡附近的細(xì)胞重排，發(fā)生心肌重構(gòu)，重構(gòu)也會使心臟收縮功能進(jìn)一步下降。如果能在早期阻斷細(xì)胞凋亡，就可以延緩或逆轉(zhuǎn)心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。

CaSR作為G蛋白偶聯(lián)受體超家族中C家族的成員之一，主要是調(diào)控機體鈣平衡[17]。近年來研究證實CaSR通過激活Fas/FasL的受體通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[18]，CaSR能直接誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[5]，CaSR可通過肌漿網(wǎng)上的IP3受體釋放大量鈣離子，進(jìn)入線粒體后引發(fā)心肌細(xì)胞[19]，CaSR還可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)緊張，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[6]。有效控制CaSR過度激活，阻斷其傳導(dǎo)通路，可以有效抑制細(xì)胞凋亡，抑制慢性心力衰竭的發(fā)展，達(dá)到治療及延緩心力衰竭的目的。

本實驗發(fā)現(xiàn)CHF時模型組大鼠心肌組織的CaSR蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較明顯升高(P<0.05)，同時模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與假手術(shù)組相比也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩者升高具有同步性。這證實了細(xì)胞凋亡參與慢性心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展，同時CaSR參與了心肌細(xì)胞凋亡過程。本實驗顯示：①中藥益氣強心飲能下調(diào)CaSR蛋白表達(dá)，與模型組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義，中藥組、西藥組相比較療效相當(dāng)；②中藥組、西藥組與模型組相比，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均有下降，有統(tǒng)計學(xué)意義，中藥組和西藥組相比療效相當(dāng)，證明兩者作用相似。益氣強心飲可下調(diào)慢性心力衰竭大鼠心肌組織鈣敏感受體蛋白表達(dá)及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，療效等同西藥對照組。這證實了益氣強心飲可抑制心肌細(xì)胞凋亡，具有治療及延緩心力衰竭發(fā)展等的作用。

慢性心力衰竭的中醫(yī)病機應(yīng)為本虛標(biāo)實之證，以氣虛、陽虛為本，以血瘀、水停為標(biāo)，治療原則以益氣溫陽、活血利水為主，其中益氣溫陽為治病之根，活血利水為治病之要，二者缺一不可。益氣強心飲是在多年臨床經(jīng)驗基礎(chǔ)上改進(jìn)完善而創(chuàng)立的經(jīng)驗方，在前期工作中，通過臨床反復(fù)論證，證實益氣強心飲可改善慢性心力衰竭病人臨床癥狀，降低病人BNP水平，提高6 min步行試驗距離[20]。益氣強心飲主要由紅參、黃芪、制附子、澤蘭、葶藶子等藥物組成，具有益氣溫陽、活血利水之功效，全方可益氣活血，氣充血行，溫陽利水，陽充水散，具有標(biāo)本并治之功，且以補為通，補中寓通，通補兼施，相得益彰。

益氣強心飲可干預(yù)慢性心力衰竭時大鼠CaSR的激活及心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能，抑制心肌重構(gòu)，治療及延緩心力衰竭的發(fā)生發(fā)展，具有抗心力衰竭的作用，在慢性心力衰竭治療方面有著廣闊的前景。