止瀉木子中錐絲堿的提取工藝△

鄭光杰，邱娜，劉凡凡，晉敦青，孫博航*

(1.沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院/基于靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)與研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110016；2.鄭州市中心醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 467000)

止瀉木子為夾竹桃科止瀉木屬止瀉木的干燥種子，其主要產(chǎn)于我國西藏、新疆、青海、廣西等高海拔地區(qū)以及印度、尼泊爾等南亞國家與地區(qū)[1]。止瀉木子具有較大的藥用價值，民族醫(yī)藥中主要用其治療赤巴病、腹瀉、痢疾等疾病[2-3]。近年來研究表明，止瀉木子中的甾體生物堿是其主要生物活性成分[4]，在這些生物堿中錐絲堿的含量較大[1]，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，錐絲堿具有較好的乙酰膽堿酯酶抑制活性，在殺滅寄生蟲、抗菌等作用方面也具有較好的藥理活性[4-9]。但是關(guān)于止瀉木子活性部位提取工藝和質(zhì)量控制研究方面尚未見到相關(guān)報道，因此本課題以止瀉木子為研究對象，以錐絲堿為指標(biāo)性成分，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化止瀉木子中錐絲堿的提取工藝[10-11]，為進(jìn)一步研究其質(zhì)量控制方法、開發(fā)利用止瀉木子的藥用經(jīng)濟(jì)價值具有重要的意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB135-S 型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；HH-S型水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；UV-1700型紫外分光光度計(jì)[島津國際貿(mào)易(上海)有限公司]；R-1001N 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；LC-NetⅡ/ADC高效液相色譜分析儀(日本分光株式會社)；DZTW調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；分析色譜柱YMC-Pack ODS-A(日本YMC公司)。

1.2 試藥

錐絲堿對照品(自制，HPLC測定含量≥98%)；甲醇(色譜純，山東禹王化工有限公司)；超純水；其他試劑均為分析純。

干燥的止瀉木子2015年7月購于安國市新輝藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地新疆，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)路金才教授鑒定為止瀉木子，藥材留樣保存于本研究室。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取干燥的止瀉木子粉末4.5 g至圓底燒瓶中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求進(jìn)行加熱回流提取，趁熱抽濾得濾液，合并濾液，減壓濃縮，將濃縮液用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，搖勻，制成供試品溶液，備用。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取錐絲堿對照品4 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即制成質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL-1的錐絲堿對照品溶液。

2.3 色譜條件

流動相95%甲醇(含二乙胺2‰)，檢測波長215 nm，柱溫25 ℃，流速0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，供試品、對照品HPLC圖見圖1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

精密配制錐絲堿儲備液(質(zhì)量濃度為1.01 mg·mL-1)，分別精密量取該儲備液1、2、4、6、8 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋到刻度，搖勻，分別進(jìn)樣。以色譜峰峰面積(Y)與對照品溶液濃度(X)進(jìn)行線性回歸分析，得線性回歸方程Y=6 780 324.63X+8 404.85，r=0.999 9。結(jié)果表明，錐絲堿在0.101～0.808 mg·mL-1色譜峰峰面積與對照品濃度線性關(guān)系良好。

注：A.錐絲堿對照品；B.供試品。圖1 錐絲堿對照品、供試品液相色譜圖

2.5 單因素試驗(yàn)

分別選取提取時間、甲醇濃度、料液比作為影響止瀉木子中錐絲堿提取工藝的3個因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果表明，提取時間在0.5～2.5 h、甲醇濃度60%～100%、料液比1∶6～1∶14存在極值。

2.6 提取條件的響應(yīng)面法優(yōu)化分析

通過響應(yīng)曲面法對影響錐絲堿提取效果較大的3個因素提取時間、甲醇濃度、料液比進(jìn)行優(yōu)化，以錐絲堿含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了三因素三水平的試驗(yàn)方案。通過單因素試驗(yàn)確定了3個因素的取值范圍。

采用Box-Behnken Design(BBD)設(shè)計(jì)三因素三水平共17組試驗(yàn)，以錐絲堿的含量(Y)為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，各因素與響應(yīng)值的回歸方程為Y=2.61+0.12A-0.030B+62.5-0.03C-0.043AB+0.020AC-0.022BC-0.19A2+0.076B2-0.034C2。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1～2。

由方差分析可知，該回歸模型P<0.000 1，表明回歸方程模型極其顯著；失擬項(xiàng)P=0.160 0>0.05，表明失擬不顯著，從而說明該模型能夠?qū)χ篂a木子中錐絲堿的提取率進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測和分析。從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知：一項(xiàng)式A、B極其顯著；二項(xiàng)式A2、B2極其顯著；交互項(xiàng)AB具有一定的顯著性，AC和BC不顯著。說明不同的提取工藝對止瀉木子中錐絲堿提取率并非簡單的線性關(guān)系。

表1 止瀉木子中錐絲堿提取工藝BBD設(shè)計(jì)因素

對擬合方程求解，得最優(yōu)提取參數(shù)：甲醇濃度73.14%；提取時間70.63 min；液料比1∶8.63，預(yù)測止瀉木子中錐絲堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.638 72 mg·g-1。考慮到實(shí)驗(yàn)的可操作性，將工藝優(yōu)化為料液比1∶9，提取時間為70 min，甲醇濃度為75%。

根據(jù)所擬合的回歸方程，作相應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面形狀，分析甲醇濃度、料液比、提取時間對止瀉木子中錐絲堿提取率的影響。其等高線圖和3D響應(yīng)曲面圖見圖2～4。3組圖直觀地反應(yīng)了各因素對響應(yīng)值的相互影響，甲醇濃度和提取時間的相互作用較顯著。等高線的形狀可反應(yīng)出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表明因素間交互作用較弱。

表2 止瀉木子中錐絲堿提取工藝BBD設(shè)計(jì)結(jié)果

注：A.錐絲堿對照品；B.供試品。圖2 提取時間與料液比的等高線圖和3D響應(yīng)曲面圖

注：A.錐絲堿對照品；B.供試品。圖3 甲醇濃度和提取時間的等高線圖和3D響應(yīng)曲面圖

注：A.錐絲堿對照品；B.供試品。圖4 料液比與甲醇濃度的等高線圖和3D響應(yīng)曲面圖

2.7 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證

平行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，錐絲堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.65、2.63、2.67，RSD為0.75%，方程預(yù)測結(jié)果與實(shí)測值之間差距較小，表明建立的數(shù)學(xué)模型具有較好的預(yù)測性。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)曲面法得到了止瀉木子中錐絲堿的最佳提取工藝條件：甲醇濃度75%；提取時間70 min；料液比1∶9。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，在該工藝條件下對錐絲堿具有較高的提取率，這為止瀉木子質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立和進(jìn)一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。