當(dāng)歸粉末顯微鑒別特征的ATR-FTIR光譜成像識(shí)別△

張久旭，翟小林，王丹，裴紋萱，董玲，孫裕，宋學(xué)斌，陳建波*，王晶娟*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029；3.蘭州佛慈制藥股份有限公司，甘肅 蘭州 730046)

當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根[1]，其作為傳統(tǒng)的藥食兩用品種，產(chǎn)銷(xiāo)量大，價(jià)格較高，經(jīng)常出現(xiàn)摻假混偽等問(wèn)題。因此，建立快速準(zhǔn)確的鑒別方法，實(shí)現(xiàn)全程質(zhì)量控制，對(duì)于保證當(dāng)歸在藥用或者食用時(shí)的真實(shí)性、有效性和安全性都是非常必要的。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(《中國(guó)藥典》)規(guī)定了當(dāng)歸粉末的顯微鑒別特征，包括薄壁細(xì)胞、導(dǎo)管和油室碎片。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，當(dāng)歸粉末的顯微鑒別特征還包括淀粉粒和木栓細(xì)胞[2-3]?；诩?xì)胞和組織形態(tài)特征的顯微鑒別法是中藥粉末鑒定的基本方法之一；但是，中藥粉末顯微鑒別主要以組織、細(xì)胞和細(xì)胞后含物的形狀、顏色等物理性質(zhì)為依據(jù)，這些顯微結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)多變，難以建立客觀量化的識(shí)別規(guī)則，判斷標(biāo)準(zhǔn)比較模糊，鑒定結(jié)果非常依賴(lài)于操作者的知識(shí)經(jīng)驗(yàn)和主觀判斷。因此，有必要發(fā)展更加客觀量化的顯微特征檢測(cè)技術(shù)。本研究即以衰減全反射傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)顯微成像技術(shù)為基礎(chǔ)，建立當(dāng)歸粉末顯微鑒別特征的化學(xué)檢測(cè)方法，進(jìn)一步提高當(dāng)歸顯微鑒別方法的客觀性和準(zhǔn)確性。

中藥粉末里很多顯微結(jié)構(gòu)的形狀、顏色等物理性質(zhì)可能具有多變的細(xì)節(jié)，但是其化學(xué)組成相對(duì)穩(wěn)定。例如，茯苓粉末里分枝狀團(tuán)塊的具體形狀有很大差異，但主要都是由β-葡聚糖類(lèi)成分組成[4]。因此，根據(jù)中藥粉末顯微結(jié)構(gòu)的化學(xué)特征對(duì)其進(jìn)行識(shí)別，可以作為形態(tài)特征識(shí)別的補(bǔ)充方法，提高顯微鑒別法的客觀性和準(zhǔn)確性。隨著儀器技術(shù)的進(jìn)步，很多以光譜、能譜或質(zhì)譜為基礎(chǔ)的顯微化學(xué)分析技術(shù)不斷發(fā)展成熟并得到廣泛應(yīng)用。相比于其他方法，顯微紅外光譜在中藥顯微化學(xué)分析方面具有一些顯著的優(yōu)勢(shì)：首先，紅外光譜是直接、無(wú)損的分析技術(shù)，不需要分離提取或分子標(biāo)記處理，容易與常規(guī)光學(xué)顯微分析相結(jié)合；其次，紅外光譜可以作為指紋圖譜同時(shí)反映樣本中全部成分的整體信息，而不是只檢測(cè)個(gè)別成分；再者，顯微紅外光譜可以達(dá)到微米級(jí)空間分辨率，而且具有很快的測(cè)試速度，能夠快速尋找到細(xì)胞或組織水平的特征顯微結(jié)構(gòu)。因此，顯微紅外光譜技術(shù)近年來(lái)已經(jīng)在中藥顯微化學(xué)分析方面得到越來(lái)越多的應(yīng)用[5-12]。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用當(dāng)歸藥材樣品于2015年采集自甘肅漳縣(1號(hào)樣品)、岷縣(2號(hào)樣品)和渭源縣(3號(hào)樣品)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院王晶娟副教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根。當(dāng)歸樣品粉碎后過(guò)60目篩，粉末直接進(jìn)行紅外光譜測(cè)試。當(dāng)歸揮發(fā)油提取按照2015版《中國(guó)藥典》四部通則2204揮發(fā)油測(cè)定法中的乙法進(jìn)行。分析純蔗糖、淀粉、草酸鈣(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，藁本內(nèi)酯對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111737)。

1.2 常規(guī)紅外光譜測(cè)試

常規(guī)紅外光譜測(cè)試所用儀器為PerkinElmer Frontier FT-IR/NIR光譜儀及其配套的UATR附件，DTGS檢測(cè)器。使用衰減全反射(ATR)方法測(cè)量樣品的紅外光譜，光譜測(cè)量范圍4000～650 cm-1，分辨率4 cm-1，每張光譜累加掃描16次，使用空氣作為光譜背景，掃描過(guò)程中自動(dòng)扣除水蒸氣和二氧化碳干擾。樣品原始測(cè)量光譜經(jīng)過(guò)PerkinElmer Spectrum v10軟件的ATR校正、自動(dòng)基線校正和歸一化處理后進(jìn)行譜圖分析。

1.3 顯微紅外光譜測(cè)試

顯微紅外光譜測(cè)試使用PerkinElmer Frontier FT-IR/NIR光譜儀與PerkinElmer Spotlight 400 FT-IR Microscope所組成的紅外光譜顯微成像系統(tǒng)以及配套的ATR光譜成像附件進(jìn)行，使用液氮冷卻的MCT線陣列檢測(cè)器。當(dāng)歸樣品粉末直接放在不銹鋼底板上進(jìn)行測(cè)試，單次測(cè)試區(qū)域500 μm×500 μm，像素尺寸6.25 μm×6.25 μm，光譜范圍4000～750 cm-1，光譜分辨率8 cm-1，每張光譜累加掃描8次，空白底板作為光譜背景。使用PerkinElmer Spectrum IMAGE v1.7軟件對(duì)原始測(cè)量光譜進(jìn)行ATR校正和空氣背景校正，然后以2100～2000 cm-1區(qū)域?yàn)閰⒖疾ǘ芜M(jìn)行基線平移校正。顯微光譜的主成分分析使用Spectrum IMAGE軟件進(jìn)行，偏最小二乘投影使用MATLAB 2016b軟件和自編程序進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 當(dāng)歸藥材及其揮發(fā)油的體相紅外光譜分析

圖1所示為甘肅漳縣、岷縣和渭源縣所產(chǎn)3個(gè)當(dāng)歸藥材樣品的體相紅外光譜。3個(gè)當(dāng)歸藥材的紅外光譜特征比較一致，主要包括：3600～3000 cm-1區(qū)域的羥基O-H伸縮振動(dòng)吸收峰、3000～2800 cm-1區(qū)域的C-H伸縮振動(dòng)吸收峰、1750 cm-1附近的羰基C=O伸縮振動(dòng)吸收峰、1640 cm-1附近的疊加峰(蛋白質(zhì)酰胺I帶、羥基O-H彎曲振動(dòng)吸收峰、芳環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰等)、1515 cm-1附近的芳環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰、1300～900 cm-1區(qū)域的疊加峰(C-O伸縮振動(dòng)峰、O-H彎曲振動(dòng)峰、糖環(huán)骨架振動(dòng)峰等)[13-14]。可以看到，3600～3000 cm-1區(qū)域和1400～800 cm-1區(qū)域的當(dāng)歸藥材紅外光譜與結(jié)晶態(tài)蔗糖非常相似，說(shuō)明當(dāng)歸藥材中含有大量的結(jié)晶態(tài)蔗糖。由于蔗糖和其他成分吸收信號(hào)的疊加，在當(dāng)歸藥材的紅外光譜上難以直接觀察到揮發(fā)油類(lèi)成分的特征吸收峰。

注：A.當(dāng)歸樣品1；B.當(dāng)歸樣品2；C.當(dāng)歸樣品3；D.蔗糖。圖1 當(dāng)歸粉末的體相紅外光譜

圖2所示為甘肅漳縣、岷縣和渭源縣所產(chǎn)3個(gè)當(dāng)歸藥材樣品揮發(fā)油的體相紅外光譜。3個(gè)當(dāng)歸藥材揮發(fā)油的紅外光譜特征比較一致，主要包括：3100～2800 cm-1區(qū)域的C-H伸縮振動(dòng)吸收峰、1760 cm-1附近的羰基C=O伸縮振動(dòng)吸收峰、1700～1550 cm-1區(qū)域的雙鍵C=C伸縮振動(dòng)吸收峰、1515 cm-1附近的芳環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰、1500～1350 cm-1區(qū)域的C-H彎曲振動(dòng)吸收峰、1300～900 cm-1區(qū)域的疊加峰(C-O伸縮振動(dòng)峰、O-H彎曲振動(dòng)峰等)[13-14]。可以看到，當(dāng)歸藥材揮發(fā)油的紅外光譜特征與藁本內(nèi)酯非常相似，說(shuō)明當(dāng)歸藥材揮發(fā)油中含有大量的藁本內(nèi)酯[15]。另外，1515 cm-1附近的芳環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰說(shuō)明當(dāng)歸藥材揮發(fā)油中含有一些芳香類(lèi)成分，與藁本內(nèi)酯不同。

注：A.當(dāng)歸樣品1揮發(fā)油；B.當(dāng)歸樣品2揮發(fā)油；C.當(dāng)歸樣品3揮發(fā)油；D.藁本內(nèi)酯。圖2 當(dāng)歸揮發(fā)油的體相紅外光譜

像素1的光譜信號(hào)中包含1757 cm-1等揮發(fā)油的特征峰，說(shuō)明該類(lèi)像素可能對(duì)應(yīng)于油室碎片。像素2的光譜信號(hào)與淀粉基本一致，說(shuō)明其對(duì)應(yīng)于淀粉粒。像素3的光譜信號(hào)與蔗糖基本一致，這些蔗糖可能存在于薄壁細(xì)胞中。像素4的光譜信號(hào)中包含1624 cm-1和1308 cm-1處的草酸鈣特征峰，說(shuō)明該類(lèi)像素可能對(duì)應(yīng)于草酸鈣晶體。像素5的光譜信號(hào)比較復(fù)雜，2921、2852、1738 cm-1等吸收峰可能來(lái)自角質(zhì)層，1513 cm-1處是芳香類(lèi)成分吸收峰，該類(lèi)像素可能對(duì)應(yīng)于細(xì)胞壁類(lèi)結(jié)構(gòu)，但是難以確定是哪種類(lèi)型的細(xì)胞。

2.2 當(dāng)歸藥材粉末顯微紅外光譜成像的非靶向分析

當(dāng)歸藥材粉末的體相紅外光譜反映的是所有化學(xué)成分的整體吸收信號(hào)，因此難以直接觀察到一些特定的結(jié)構(gòu)或成分特征吸收信號(hào)。當(dāng)歸藥材粉末具有多種微觀結(jié)構(gòu)，也就是說(shuō)其化學(xué)成分的空間分布是不均勻的。通過(guò)顯微紅外光譜成像技術(shù)對(duì)當(dāng)歸藥材粉末的大量微區(qū)(每個(gè)微區(qū)稱(chēng)為一個(gè)像素)進(jìn)行測(cè)試，使用一定的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，可以獲得某些特定成分光譜信號(hào)及其空間分布信息，了解特定顯微結(jié)構(gòu)的化學(xué)組成。圖3所示漳縣所產(chǎn)當(dāng)歸樣品粉末的ATR-FTIR顯微光譜成像主成分分析結(jié)果，是根據(jù)不同像素顯微紅外光譜前3個(gè)主成分得分而生成的贗彩色圖像。具有相似光譜特征的像素在不同主成分上的得分接近，因而在贗彩色圖像上具有相似的顏色。從圖3中可以看出，當(dāng)歸藥材粉末中存在多種類(lèi)型的像素，一些代表性的像素光譜(其空間位置標(biāo)注在圖3中)如圖4所示。

圖3 當(dāng)歸樣品1粉末ATR-FTIR顯微光譜成像主成分分析結(jié)果

圖4 當(dāng)歸樣品1粉末ATR-FTIR顯微光譜成像典型像素光譜

2.3 當(dāng)歸藥材粉末顯微紅外光譜成像的靶向檢測(cè)

根據(jù)前面的結(jié)果分析可知，當(dāng)歸藥材粉末的顯微紅外光譜圖像中包含揮發(fā)油、淀粉、蔗糖、草酸鈣和細(xì)胞壁等幾類(lèi)微觀結(jié)構(gòu)。因此，可以使用靶向檢測(cè)的方法，在當(dāng)歸藥材粉末中定向?qū)ふ疫@些顯微光譜特征。從圖4顯示的像素光譜可知，單個(gè)像素光譜通常不能等同于單一化學(xué)成分，總是或多或少存在其他成分的干擾信號(hào)。因此，在當(dāng)歸藥材粉末中靶向檢測(cè)特征顯微光譜信號(hào)時(shí)，需要使用對(duì)未知背景信號(hào)具有較強(qiáng)抗干擾能力的算法。本研究使用偏最小二乘投影法[16]，在當(dāng)歸藥材粉末的顯微紅外光譜圖像中尋找揮發(fā)油、淀粉、蔗糖和草酸鈣的特征信號(hào)較強(qiáng)的像素。不同類(lèi)型細(xì)胞的細(xì)胞壁成分具有差異，在尚未確定特定類(lèi)型細(xì)胞壁特征吸收信號(hào)的狀態(tài)下，本研究暫不將細(xì)胞壁作為目標(biāo)檢測(cè)信號(hào)之一。

圖5所示為甘肅漳縣、岷縣和渭源縣所產(chǎn)3個(gè)當(dāng)歸藥材粉末ATR-FTIR顯微光譜成像的特征信號(hào)靶向檢測(cè)結(jié)果，是目標(biāo)光譜投影值最高的像素光譜。3個(gè)樣品中均能順利找出具有揮發(fā)油、淀粉、蔗糖和草酸鈣特征吸收信號(hào)的像素光譜，說(shuō)明這些光譜信號(hào)作為當(dāng)歸藥材粉末的顯微紅外光譜鑒定特征是可行的。

注：A1～A4.當(dāng)歸樣品1；B1～B4.當(dāng)歸樣品2；C1～C4.當(dāng)歸樣品3。圖5 當(dāng)歸粉末ATR-FTIR顯微光譜特征靶向檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

紅外光譜用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的根本優(yōu)勢(shì)在于直接無(wú)損，樣品不需要進(jìn)行分離提取或衍生化等分子標(biāo)記處理，可以顯著地節(jié)省檢測(cè)過(guò)程的人力、物力、時(shí)間、化學(xué)品消耗。但是，中藥樣品不經(jīng)分離而直接進(jìn)行紅外光譜測(cè)試時(shí)，樣品中各種成分的吸收信號(hào)疊加在一起，弱吸收信號(hào)被強(qiáng)吸收信號(hào)所掩蓋，難以找出微量成分的特征信號(hào)。本研究的結(jié)果說(shuō)明，使用顯微紅外光譜成像技術(shù)對(duì)中藥粉末進(jìn)行表征，可以將顯微物理結(jié)構(gòu)與顯微化學(xué)成分相結(jié)合，以物理分離代替化學(xué)分離而實(shí)現(xiàn)微量成分信息的挖掘。

根據(jù)中藥粉末顯微結(jié)構(gòu)的化學(xué)特征對(duì)其進(jìn)行識(shí)別，可以作為形態(tài)特征識(shí)別的補(bǔ)充方法，提高顯微鑒別法的客觀性和準(zhǔn)確性。使用ATR-FTIR顯微光譜成像技術(shù)檢測(cè)其中的揮發(fā)油、淀粉、蔗糖和草酸鈣特征吸收信號(hào)，可以作為當(dāng)歸藥材粉末的光譜顯微鑒別特征，為當(dāng)歸的質(zhì)量控制提供一種有效的檢測(cè)方法。