基于組分配伍探討黃連 黃芩保肝的物質(zhì)基礎(chǔ)△

段玉紅，蘇虹霞，楊紅蓮

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌二科，陜西 咸陽(yáng) 712000)

現(xiàn)在隨著藥物種類的不斷增多，藥物性肝病的發(fā)生也逐年增加。對(duì)乙酰氨基酚(paracetamol，APAP)也叫撲熱息痛，為臨床常用解熱鎮(zhèn)痛藥，在大多數(shù)國(guó)家是非處方藥，為經(jīng)典的解熱鎮(zhèn)痛藥[1]，在正常劑量服用是安全的，然而大劑量服用時(shí)會(huì)導(dǎo)致肝毒性。APAP成藥規(guī)格不同、種類多，包括多種復(fù)方制劑，在使用和銷售過(guò)程中都比較隨意，造成大量的不良反應(yīng)。其中比較嚴(yán)重、不能忽視的是APAP對(duì)肝臟的損傷。更為嚴(yán)重者會(huì)引發(fā)肝功能衰竭，甚至危及生命[2-3]。研究者發(fā)現(xiàn)人體服用過(guò)量的APAP，經(jīng)過(guò)細(xì)胞色素P450酶代謝，CYP450是人體重要的I相藥物代謝酶，種類繁多，可分為不同的家族，能代謝和轉(zhuǎn)化外源性和內(nèi)源性化合物，減弱化合物的毒性或者使其毒性喪失。

已有研究報(bào)道，許多中藥能保護(hù)APAP造成的肝損傷[4-6]；而且中藥副作用小，臨床應(yīng)用更廣泛[7]。黃連(Rhizoma coptidis)是毛茛科植物三角葉黃連或云連的干燥根莖，中國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功能[8]。其主要含有生物堿、小檗堿、黃連堿、黃連寧、巴馬汀等化學(xué)成分?，F(xiàn)在藥理學(xué)研究表明，黃連具有降血糖、保肝、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、改善心血管、降血壓等藥效[9-10]。黃連作為清熱解毒中藥，不僅藥理作用廣泛，還有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。黃芩(Scutellaria baicalensis)為唇形科植物黃芩的根部，其在保肝、抗病毒、抗菌、抗氧化、消除自由基、抗過(guò)敏、保護(hù)神經(jīng)元等多方面發(fā)揮作用[11]。臨床上黃芩素膠囊能有效治療急性肝炎。黃芩、黃連配伍使用在許多經(jīng)典方劑中都有體現(xiàn)[12]，黃芩、黃連藥對(duì)始見(jiàn)于唐代王煮《外臺(tái)秘要》中的黃連解毒湯[10]，方中黃芩與黃連的配伍比例為1∶1，也出自于《傷寒論》，目前也已經(jīng)成為臨床上常用的治療2型糖尿病、腸道菌群等疾病的藥對(duì)之一。CYP450酶是體內(nèi)重要的代謝酶，尤其對(duì)毒性化合物在體內(nèi)代謝發(fā)揮重要作用，但是黃連、黃芩有效化學(xué)成分對(duì)CYP450亞酶活性的影響尚不明確，所以本實(shí)驗(yàn)基于計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)研究黃連、黃芩化學(xué)成分與CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4和CYP2C9的相關(guān)性，預(yù)測(cè)可能結(jié)合的作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步從分子水平上探討黃連、黃芩保肝的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 配體庫(kù)的構(gòu)建 基于TCMSP和TCM@taiwan網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺(tái)篩選黃連-黃芩的化學(xué)成分，參照Lipinski 五規(guī)則的相關(guān)指標(biāo)，符合 Lipinski 5個(gè)規(guī)則更有可能成為口服藥物，多數(shù)認(rèn)為具有較好的ADME(absorption，distribution，metabolism，excretion)性質(zhì)[13]。 黃連、黃芩化學(xué)成分篩選需要同時(shí)滿足：DL(類藥性)≥0.18，MW(分子量)≤500，2≤AlogP(脂水分配系數(shù)的對(duì)數(shù)值)≤5，OB(口服生物利用度)≥40%。OB受多種因素的影響，很多新藥在開發(fā)過(guò)程中沒(méi)有達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的OB，不能開發(fā)到臨床。一般認(rèn)為 DL≥0.18 的分子具有較好的類藥性。通過(guò)Drug Bank篩選陽(yáng)性藥[14]，谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)可以解救大劑量對(duì)乙酰氨基酚造成的藥物性肝損傷。谷胱甘肽在機(jī)體內(nèi)是重要的自由基清除劑，同時(shí)也具有抗氧化能力?？梢园褭C(jī)體內(nèi)有毒的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無(wú)毒物質(zhì)，排出體內(nèi)。N-乙酰半胱氨酸是巰基供體，能快速解救對(duì)乙酰氨基酚引起的肝損害。所有的化合物采用Open Babel-2.4.1 構(gòu)建成三維結(jié)構(gòu)，并對(duì)其加電荷、加氫，保存為mol2 格式。

1.1.2 CYP450亞酶晶體結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備 CYP450亞酶晶體結(jié)構(gòu)從PDB庫(kù)(Protein Data Bank)中下載，CYP2E1、CYP3A4、CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9的 PDB ID分別為3E6I、4NY4、2HI4、4WNU、4NZ2[14]。生物學(xué)效應(yīng)見(jiàn)表1。

表1 靶標(biāo)蛋白的基本信息

1.2 基于iGEMDOCK 進(jìn)行虛擬篩選

iGEMDOCK是一個(gè)開源的分子對(duì)接軟件[18]，操作簡(jiǎn)單，對(duì)接準(zhǔn)確度較高，主要用于初篩和精度對(duì)接。小分子和大分子在進(jìn)行構(gòu)象匹配時(shí)，通用的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)接方法為：子代(Generation)=70，Number of solution(解的個(gè)數(shù))=2，generic evolutionary method中群體大小(population size)設(shè)為200。對(duì)黃連、黃芩化合物和CYP450亞酶的結(jié)合腔穴進(jìn)行對(duì)接。讓小分子和大分子在幾何、能量匹配的原則上相互識(shí)別，尋找與CYP450亞酶匹配能量最低的小分子。在構(gòu)象搜索過(guò)程中，該軟件考慮了氫鍵、范德華力和靜電作用進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)打分。

1.3 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建

基于Cytoscape構(gòu)建黃連、黃芩和CYP450亞酶的網(wǎng)絡(luò)模型，現(xiàn)在用于網(wǎng)絡(luò)分析的工具主要有Cytoscape、數(shù)據(jù)可視化工具Gephi、Wireshark等，其中應(yīng)用比較廣泛的為Cytoscape，其為一款開源的可視化軟件，操作簡(jiǎn)單、快速，可以系統(tǒng)整合復(fù)雜的分子之間的相關(guān)性[19]。黃連、黃芩28個(gè)化學(xué)成分與5個(gè)CYP450亞酶進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作分析。網(wǎng)絡(luò)包含有效的化學(xué)成分和CYP450 2 類節(jié)點(diǎn)(node)。若CYP450為某化學(xué)成分的潛在作用靶點(diǎn)，則以邊(edge)相連。

2 結(jié)果

2.1 黃連、黃芩化學(xué)成分

參照Lipinski 五規(guī)則，黃連、黃芩符合條件的化合物一共有28個(gè)，其中黃連和黃芩有1個(gè)相同的化學(xué)成分，黃芩19個(gè)化學(xué)成分，黃連9個(gè)化學(xué)成分。具體信息詳見(jiàn)表2。

表2 黃連-黃芩化學(xué)成分

2.2 iGEMDOCK分子對(duì)接結(jié)果

iGEMDOCK結(jié)果以小分子和大分子匹配能量的多少?zèng)Q定結(jié)合的程度。如果匹配能量比較低，說(shuō)明小分子和大分子結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定。匹配能量比較高，說(shuō)明結(jié)合的構(gòu)象相對(duì)不穩(wěn)定。將黃連、黃芩中28個(gè)化合物與CYP450酶的5個(gè)亞型進(jìn)行能量匹配。結(jié)果顯示：28個(gè)化合物與CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6、 CYP2C9有較好的結(jié)合，與CYP3A4結(jié)合的沒(méi)有陽(yáng)性藥谷胱甘肽構(gòu)象穩(wěn)定。對(duì)接結(jié)果見(jiàn)圖1和表3。

圖1 黃連、黃芩化學(xué)成分與CYP2D6對(duì)接結(jié)果

2.3 黃連、黃芩化學(xué)成分與CYP450亞酶的網(wǎng)絡(luò)互作分析

黃連、黃芩28個(gè)化學(xué)成分，與CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6、CYP2C9、CYP3A4進(jìn)行對(duì)接。陽(yáng)性藥谷胱甘肽與CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6、CYP2C9、CYP3A4對(duì)接能量分別為-121、-130、-132、-126、-142 kcal·mol-1。而N-乙酰半胱氨酸整體匹配能量都較高，說(shuō)明構(gòu)象不穩(wěn)定。所以黃連-黃芩主要與陽(yáng)性藥谷胱甘肽進(jìn)行比較。黃連、黃芩選擇CYP1A2≤-121 kcal·mol-1，CYP2E1≤-130 kcal·mol-1，CYP2D6≤-132 kcal·mol-1，CYP2C9≤-126 kcal·mol-1，CYP3A4≤-142 kcal·mol-1進(jìn)行小分子和大分子關(guān)聯(lián)性分析。發(fā)現(xiàn)黃連、黃芩同時(shí)能與CYP1A2作用，黃連中的7個(gè)化學(xué)成分(Moupinamide，Palmatine，(R)-Canadine，Corchoroside A_qt，quercetin，Worenine，Epiberberine)與CYP1A2具有較低的結(jié)合能和較強(qiáng)的抑制作用，其中作用最強(qiáng)的是(R)-Canadine。黃芩中的4個(gè)化學(xué)成分(bis[(2S)-2- ethylhexyl]，5，7，4′-trihydroxy-8-methoxy flavanone，Epiberberine，NEOBAICALEIN)對(duì)CYP1A2有較強(qiáng)的抑制作用，其中作用最強(qiáng)的為NEOBAICALEIN。黃連、黃芩共有10個(gè)化學(xué)成分同時(shí)與CYP1A2結(jié)合，抑制其活性。其中Epiberberine為黃連、黃芩共有化學(xué)成分。同時(shí)黃連、黃芩共有3個(gè)成分同時(shí)與CYP2C9結(jié)合。黃芩中的3個(gè)化學(xué)成分與CYP2E1結(jié)合，2個(gè)化學(xué)成分與CYP2D6結(jié)合，而黃連與CYP2E1、CYP2D6的結(jié)合沒(méi)有陽(yáng)性藥結(jié)合的穩(wěn)定。黃連、黃芩通過(guò)與CYP450亞酶結(jié)合，黃連主要抑制CYP1A2和CYP2C9的活性，而黃連主要抑制CYP1A2、CYP2C9、 CYP2E1、 CYP2D6的活性。具體結(jié)果見(jiàn)圖2。

表3 黃連-黃芩與CYP450亞酶對(duì)接得分

3 討論

CYP2E1是一種I相毒物代謝酶，為代謝某些外源性和內(nèi)源性化合物的重要酶系，是CYP450代謝酶家族中的重要一員。CYP1A2主要存在于人體的肝臟中，主要負(fù)責(zé)雜環(huán)胺類、芳香烴類和多數(shù)臨床藥物的代謝。CYP2E1和CYP1A2都具有破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、導(dǎo)致酶活性異常或失活、抑制基因表達(dá)甚至導(dǎo)致基因突變、加快細(xì)胞凋亡、導(dǎo)致機(jī)體疾病的發(fā)生或增加患病幾率。很多藥物的療效或毒性與CYP1A2和CYP2E1酶的活性有關(guān)，所以CYP1A2和CYP2E1一直受到毒理、藥理和藥物致癌等多個(gè)研究領(lǐng)域的關(guān)注[20]。APAP在治療劑量下，約5%～10%的APAP被CYP2E1、CYP3A4等代謝為具有肝毒性的N-乙酰對(duì)苯醌亞胺(NAPQI)，與還原型谷胱甘肽結(jié)合，消除其毒性。因此，在治療劑量下，APAP不會(huì)產(chǎn)生肝毒性。但是在大劑量服用時(shí)，特別是CYP2E1、CYP1A2等酶的誘導(dǎo)下，APAP產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物比較多，還原型谷胱甘肽無(wú)法全部消除，導(dǎo)致肝毒性。CYP2C9占CYP450蛋白總量的 15%～20%，在肝臟中表達(dá)，參與多種藥物的代謝。CYP3A4是CYP3家族A亞家族發(fā)現(xiàn)的第四種酶，主要負(fù)責(zé)機(jī)體內(nèi)50%以上的臨床用藥[19]。CYP2D6參與多種重要藥物代謝，APAP在體內(nèi)一部分也是通過(guò)CYP2D6進(jìn)行代謝，但其高濃度時(shí)出現(xiàn)毒性作用[21]。因此可以通過(guò)抑制CYP450亞酶減弱APAP造成的肝損傷，減少毒性物質(zhì)NAPQI的生成量。黃連、黃芩藥理作用都具有保肝作用，同時(shí)又是清熱解毒中藥，臨床應(yīng)用廣泛，副作用少，無(wú)毒。黃連、黃芩10個(gè)化學(xué)成分(Moupinamide，Palmatine，(R)-Canadine，Corchoroside A_qt，quercetin，Worenine，bis[(2S)-2-ethylhexyl]，NEOBAICALEIN，5，7，4′-trihydroxy-8-methoxyflavanone，Epiberberine)共同抑制CYP1A2的活性。3個(gè)化學(xué)成分共同抑制CYP2C9的活性。而且黃芩對(duì)CYP2E1、CYP2D6的活性也有影響。進(jìn)一步表明黃連、黃芩配伍使用可能保肝效果更好。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)CYP450酶系可能是黃連、黃芩降低藥物性肝損傷的作用靶點(diǎn)，減少肝細(xì)胞損傷，從而達(dá)到保肝作用。

注：黃色表示黃連-黃芩共有化學(xué)成分；藍(lán)色表示化學(xué)成分；紅色表示CYP450亞酶。圖2 黃連-黃芩化學(xué)成分-CYP450亞型的網(wǎng)絡(luò)模型