兩種膽汁淤積模型肝毒性及膽汁酸代謝調(diào)控模式研究*

陳楚穎 代曼云 徐港銘 華慧英 劉愛(ài)明

寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理藥理學(xué)系 (浙江 寧波， 315211)

α-萘異硫氰酸酯(ANIT)膽汁淤積模型是最經(jīng)典的肝內(nèi)膽汁淤積模型，病理機(jī)制清楚，建立方法成熟，常用于藥物保肝及利膽作用機(jī)制的研究[1，2]。石膽酸(LCA)膽汁淤積模型是較新的模型，近年來(lái)越來(lái)越廣泛用于研究藥物對(duì)膽汁淤積基因的誘導(dǎo)和調(diào)控等方面[3～5]，但該模型病理機(jī)制尚未完全清楚，建模方法也不完全一致。目前尚未見(jiàn)比較兩種模型生化、病理，及膽汁酸代謝排泄變化規(guī)律的報(bào)道。本研究擬在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下系統(tǒng)比較兩種模型的生化反應(yīng)、病理機(jī)制和膽汁酸調(diào)控模式的相同和不同點(diǎn)，為膽汁淤積性肝病的病理機(jī)制探討與藥物研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 ①動(dòng)物：成年清潔級(jí)雄性健康小鼠20只，體重25 g±2 g，由寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào)：SYSK(浙)2013-0191。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。②藥物與試劑：LCA(Sigma)，ANIT(Sigma)，Trizol(Invitrogen，USA)，HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒，定量PCR試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技公司)，堿性磷酸酶(ALP)、總膽汁酸(TBA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等檢測(cè)試劑盒(寧波瑞源生物科技公司)。

1.2 分組與造模 ①LCA模型建立：取10只小鼠，隨機(jī)分為L(zhǎng)CA對(duì)照組和LCA實(shí)驗(yàn)組，各5只。LCA對(duì)照組小鼠以玉米油灌胃；LCA實(shí)驗(yàn)組小鼠以LCA-玉米油溶液灌胃(即先按15g/L濃度將LCA溶于玉米油，然后以300mg/kg/d的劑量灌胃)。灌胃體積均為0.1ml/10g，2次/d。第5次給藥12h后處死小鼠并取材。②ANIT模型建立：取10只小鼠，隨機(jī)分為ANIT對(duì)照組和ANIT實(shí)驗(yàn)組，各5只。ANIT對(duì)照組小鼠以玉米油單次灌胃；ANIT實(shí)驗(yàn)組小鼠以ANIT-玉米油灌胃(即先以7.5g/L濃度將ANIT溶于玉米油，然后以75mg/kg劑量單次灌胃)。灌胃體積均為0.1ml/10g，灌胃48h后處死小鼠。

1.3 膽汁酸代謝轉(zhuǎn)運(yùn)基因的轉(zhuǎn)錄分析

1.3.1 總RNA提取 稱取20 mg肝臟組織加入100 μl Trizol勻漿，加入氯仿，離心分層，取30 μl上清液，加入等體積異丙醇沉淀RNA，75% 酒精洗滌兩次，DEPC水溶解，即提取總RNA。Nano Drop 2000測(cè)定吸光度(A)，做總RNA的純度以及濃度檢測(cè)，A260/280大于1.9的樣品用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取1 μg總RNA，加入逆轉(zhuǎn)錄試劑dNTP Mix 4 μl，oligo (dT) Primer 2 μl，DDT 2 μl，HifiScript 1 μl，再加入RNase-Free Water補(bǔ)充逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系至20 μl體系，于PCR儀中反應(yīng)合成cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 定量PCR測(cè)定 反應(yīng)體系10 μl，其中包括：模版cDNA 1 μl，Master Mix 5 μl，上游引物0.2 μl，下游引物0.2 μl，DEPC水3.6 μl。PCR儀中95℃變性10 s、55℃退火10 s、72℃延伸15 s。反應(yīng)結(jié)束后，熒光定量PCR儀自動(dòng)分析得到Cp值。其中，實(shí)驗(yàn)中所設(shè)計(jì)的引物序列見(jiàn)表1，所有的引物序列均來(lái)源于引物數(shù)據(jù)庫(kù)(http://mouseprimerdepot.nci.nih.gov/)，并經(jīng)過(guò)溶解曲線分析驗(yàn)證其專屬性。

將目標(biāo)基因組平行樣的Cp值取平均數(shù)并計(jì)算樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差STDEV與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差rsd，用目標(biāo)基因的Cp值分別減去同一樣本的內(nèi)參的Cp值得dCT，再用實(shí)驗(yàn)組的dCT分別減去對(duì)照組dCT得到ddCT，取得Power值，并計(jì)算Power值平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 標(biāo)本采集及保存 開(kāi)始造模0、12、24、36 h通過(guò)尾靜脈采血50 μl，48 h后小鼠經(jīng)二氧化碳麻醉后，眼眶采血，血液收集于1.5 ml離心管中；經(jīng)4℃ 2000 r/min離心5 min后，取血清，轉(zhuǎn)移至-20℃保存。小鼠脫頸處死后，打開(kāi)腹腔，充分暴露肝臟，取全部肝組織，稱重并記錄后，取一半肝大葉于10%中性福爾馬林溶液中固定，其余肝臟組織及時(shí)經(jīng)液氮速凍后，轉(zhuǎn)移至-80℃凍存。

1.5 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的實(shí)驗(yàn)方法，采用酶標(biāo)儀分別測(cè)定ALP、TBA、AST、ALT。

1.6 肝臟組織病理學(xué)檢測(cè) 小鼠肝臟于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h后，梯度酒精脫水，石蠟包埋，4 μm常規(guī)切片，42℃攤片，蘇木素-伊紅染色后用樹(shù)脂膠封片，24 h后OLYMPUS CX31顯微鏡下放大40倍及400倍觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0軟件包對(duì)生化結(jié)果及膽汁酸代謝基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行處理，多組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠48h時(shí)生化指標(biāo)結(jié)果 見(jiàn)表2。與LCA對(duì)照組相比，LCA實(shí)驗(yàn)組小鼠ALP未見(jiàn)明顯變化，TBA升高28.6倍，ALT升高133.2倍，AST升高86.5倍。與ANIT對(duì)照組小鼠相比，ANIT實(shí)驗(yàn)組小鼠ALP升高7.5倍，TBA升高30倍，ALT升高約28.8倍，AST升高23.5倍。LCA實(shí)驗(yàn)組小鼠ALT和AST高于ANIT實(shí)驗(yàn)組，顯示當(dāng)前實(shí)驗(yàn)劑量下，LCA實(shí)驗(yàn)組小鼠肝細(xì)胞損傷較重；而ANIT實(shí)驗(yàn)組小鼠ALP高于LCA實(shí)驗(yàn)組，提示ANIT實(shí)驗(yàn)組小鼠膽汁淤積較重。

2.2 兩實(shí)驗(yàn)組小鼠4時(shí)間段各生化指標(biāo)變化情況 見(jiàn)表3。從0～36h各生化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化結(jié)果顯示，ANIT實(shí)驗(yàn)組小鼠ALP水平始終高于LCA實(shí)驗(yàn)組；ANIT實(shí)驗(yàn)組小鼠早期TBA水平高于LCA實(shí)驗(yàn)組，24h后兩組小鼠TBA水平基本相當(dāng)；而LCA實(shí)驗(yàn)組小鼠ALT、AST水平始終高于ANIT實(shí)驗(yàn)組，這提示ANIT主要損傷膽管系統(tǒng)，而LCA主要損傷肝細(xì)胞。

2.3 4組小鼠肝臟組織病理學(xué)情況 兩對(duì)照組小鼠肝臟大小、輪廓、顏色正常；肝組織鏡下病理觀察，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝竇呈放射狀排列，肝細(xì)胞核大而圓，核膜清晰，胞漿豐富且淡染(見(jiàn)插頁(yè)圖1A、E)。LCA實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟壞死灶周圍肝細(xì)胞普遍水腫，細(xì)胞內(nèi)有大量空泡，胞核位于中央，壞死灶有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為中性粒細(xì)胞，肝竇充血，膽小管輕度擴(kuò)張(見(jiàn)插頁(yè)圖1B、C、D)。ANIT實(shí)驗(yàn)組小鼠壞死灶周圍肝細(xì)胞輕度水腫，壞死灶中可見(jiàn)中性粒細(xì)胞，肝竇嚴(yán)重充血，膽小管明顯擴(kuò)張(見(jiàn)插頁(yè)圖1F、G、H)。

表1 膽汁酸代謝轉(zhuǎn)運(yùn)基因引物序列及產(chǎn)物

2.4 4組小鼠膽汁酸合成、攝取基因表達(dá)情況 見(jiàn)表4。Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1是最主要的參與膽汁酸合成的基因，對(duì)維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)具有重要作用[6]。與LCA對(duì)照組比較，LCA實(shí)驗(yàn)組小鼠Cyp7a1降至0.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Cyp8b1降至0.7%，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而Cyp27a1在兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與ANIT對(duì)照組比較，ANIT實(shí)驗(yàn)小鼠Cyp7a1降至1.5%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Cyp8b1降至5.5%，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而Cyp27a1在兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這提示LCA和ANIT對(duì)Cyp7a1、Cyp8b1基因表達(dá)可能是經(jīng)過(guò)核受體反饋性調(diào)節(jié)。

與LCA對(duì)照組比較，LCA實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟膽汁酸攝取基因Oatp1降至32%、Oatp2降至46%、Nctp降至25%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與ANIT對(duì)照組比較，ANIT實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟Oatp1降至47%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而Oatp2、Nctp兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 4組小鼠膽汁酸排泄基因表達(dá)情況 見(jiàn)表5。Mdr2、Bsep是毛細(xì)膽管膜側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因，與LCA對(duì)照組比較，LCA實(shí)驗(yàn)組小鼠Mdr2升高158倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而B(niǎo)sep在兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與ANIT對(duì)照組比較，ANIT實(shí)驗(yàn)組小鼠Mdr2升高12.1倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Bsep升高4倍，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Mrp2、Mrp3、Mrp4、Ostb是血管側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因,Mrp2、Mrp4在LCA對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而LCA實(shí)驗(yàn)組小鼠Mrp3較對(duì)照組升高3.3倍、Ostb升高202倍，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與ANIT對(duì)照組比較，ANIT實(shí)驗(yàn)組小鼠Mrp3升高8倍、Mrp4升高6.5倍、Ostb升高200倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；而Mrp2在兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 4組小鼠PPARα靶基因表達(dá)情況 見(jiàn)表6。Acot1、Ehhadh、Cyp4a10是PPAR靶基因，在兩實(shí)驗(yàn)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示膽汁淤積所引起的細(xì)胞毒性并未導(dǎo)致基因表達(dá)的改變，上述膽汁酸代謝基因表達(dá)的變化是反饋性調(diào)控的結(jié)果。

表2 4組小鼠實(shí)驗(yàn)48h時(shí)各生化指標(biāo)結(jié)果比較

與同藥物對(duì)照組比較，**P<0.01；與LCA實(shí)驗(yàn)組比較，△△P<0.01

表3 兩實(shí)驗(yàn)組小鼠4時(shí)間段各生化指標(biāo)結(jié)果比較

表4 4組小鼠膽汁酸合成、攝取基因表達(dá)比較

表5 4組小鼠膽汁酸排泄基因表達(dá)比較

表6 4組小鼠PPARα靶基因表達(dá)比較

3 討論

LCA是一種單羥基膽汁酸，是主要的膽汁酸成分之一，是肝毒性最強(qiáng)的單體膽汁酸[7]。正常時(shí)機(jī)體主要在肝臟降解LCA，從而維持LCA的低濃度，避免對(duì)機(jī)體造成損害。LCA誘導(dǎo)的膽汁淤積模型通過(guò)在短時(shí)間內(nèi)大劑量給予LCA，直接提升機(jī)體中的LCA負(fù)荷水平，通過(guò)其毒性作用造成膽汁淤積性肝損傷[8]。ANIT是一種可造成急性膽損傷的肝毒物，主要通過(guò)損傷小膽管上皮細(xì)胞，破壞其排泄功能，導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積，繼而導(dǎo)致局部與散在的肝細(xì)胞溶解性壞死，表現(xiàn)為血液中的膽紅素與轉(zhuǎn)氨酶水平顯著上升，常用于小鼠的肝臟膽汁淤積模型建立[9]。ANIT膽汁淤積模型的病理生理過(guò)程與臨床膽汁淤積的實(shí)際病理過(guò)程最為接近，實(shí)驗(yàn)研究中也最為常用[10]。

從生化指標(biāo)角度對(duì)比，兩種膽汁淤積模型變化趨勢(shì)基本一致，但變化倍數(shù)有所差異，可能與LCA及ANIT的使用劑量不同、給藥次數(shù)不同造成膽汁淤積的程度不同有關(guān)。通過(guò)對(duì)膽管損傷與肝細(xì)胞損傷標(biāo)志性生化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可見(jiàn)，ALP和TBA水平在ANIT模型中更早出現(xiàn)大幅升高，ALT與AST水平則在LCA模型中更早升高，這種毒性表現(xiàn)與ANIT作用于膽管上皮細(xì)胞的機(jī)制相符[11]，同時(shí)可推測(cè)LCA主要是對(duì)肝細(xì)胞造成損傷。

肝組織病理學(xué)結(jié)果表明，LCA實(shí)驗(yàn)組小鼠肝細(xì)胞水腫嚴(yán)重，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)量大，肝竇充血較輕，且膽小管輕度擴(kuò)張，提示LCA可能影響肝細(xì)胞膜通透性并引起炎癥反應(yīng)。ANIT實(shí)驗(yàn)組小鼠肝細(xì)胞水腫較輕微，少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肝竇嚴(yán)重淤血且有出血現(xiàn)象，膽小管嚴(yán)重?cái)U(kuò)張，符合ANIT造模機(jī)制中作用于膽管上皮細(xì)胞，肝竇嚴(yán)重淤血?jiǎng)t由肝細(xì)胞受損、肝竇回流受阻引起[12]，提示LCA模型中主要損傷表現(xiàn)為肝細(xì)胞水腫和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，而ANIT模型中主要損傷肝竇和膽小管。

基因表達(dá)的結(jié)果提示，兩實(shí)驗(yàn)組小鼠膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、排泄基因變化趨勢(shì)基本一致，僅存在變化程度差異。合成攝取基因比較結(jié)果提示LCA和ANIT對(duì)膽汁酸攝取途徑的影響均較小；排泄基因比較結(jié)果提示，Mdr-2的變化在兩實(shí)驗(yàn)組小鼠均存在。兩實(shí)驗(yàn)組小鼠膽汁酸水平升高后反饋性調(diào)控膽汁酸合成、攝取和排泄基因的表達(dá)，努力維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)，變化的數(shù)量級(jí)差異可能是由于LCA本身是FXR等肝汁酸受體的強(qiáng)反饋因素，其反饋性調(diào)控的強(qiáng)度更大[13]。

兩種模型膽汁酸升高時(shí)間不同，提示其成模損傷機(jī)制不同，與經(jīng)典的ANIT模型相比，LCA模型中肝細(xì)胞損傷生化標(biāo)志物首先升高，病理表現(xiàn)主要為肝細(xì)胞毒性。兩種工具藥物的造模機(jī)制不同，但膽汁酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明兩種模型中基因變化更多是膽汁淤積升高后的反饋性調(diào)節(jié)的結(jié)果。這種強(qiáng)大的反饋性調(diào)控在實(shí)驗(yàn)研究中可能會(huì)掩蓋干預(yù)因素所引起的調(diào)控效應(yīng)，因此，在膽汁淤積治療性或防護(hù)性機(jī)制研究中[14,15]，應(yīng)謹(jǐn)慎判斷其基因表達(dá)變化是反饋性調(diào)控的結(jié)果，還是治療防護(hù)因素的直接作用結(jié)果。