柯薩奇B3病毒感染對(duì)HL-1心肌細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞的影響研究

彭俊，魏文娟，錢正明，黃建振，高世龍，張召才

擴(kuò)張型心肌病（DCM）是一種以單側(cè)或雙側(cè)心腔擴(kuò)大、心肌收縮功能減退、伴或不伴充血性心力衰竭為特征的心肌病。病毒性心肌炎是形成DCM的重要病因［1］，可引起心肌炎的病毒種類很多，其中以柯薩奇B組病毒（CVB）最為常見［2］。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是一組成體干細(xì)胞，因其具有多向分化潛能、擴(kuò)增迅速且低免疫原性［3］而被廣泛應(yīng)用于急性心肌梗死［4-5］及慢性心力衰竭［6-7］的實(shí)驗(yàn)研究中。心肌炎遠(yuǎn)期可進(jìn)展成DCM，但是MSC治療可否用于急性心肌炎患者目前尚不清楚。為此，本研究比較了病毒性心肌炎主要致病病毒——柯薩奇B3病毒（CVB3）感染對(duì)HL-1心肌細(xì)胞及MSC的影響，試圖尋找一種新的心肌炎的治療措施。

1 材料與方法

1.1 研究時(shí)間 本研究時(shí)間為2015年6月—2017年6月。

1.2 主要試劑及儀器 Claycomb培養(yǎng)基（SAFC Biosciences公司），DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基（Invitrogen公司），胎牛血清（FBS）、MEM2×培養(yǎng)基（Gibco公司），腎上腺素、L-谷氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、氯仿（Sigma公司），堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Peptotech公司），SYBR green定量PCR預(yù)混液（Eurogentec公司），異丙醇（美國(guó)默克公司），1.3%純化瓊脂（Difco公司），大容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、7900HT快速實(shí)時(shí)PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），CellTiter 96?AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Promega公司），VersaMax讀板機(jī)〔美谷分子儀器（上海）有限公司〕。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠心肌細(xì)胞株HL-1心肌細(xì)胞保持了成年鼠心肌細(xì)胞的生物學(xué)特征，由德國(guó)U.Rauch教授贈(zèng)予。Claycomb培養(yǎng)基含10% FBS、0.1 mmol/L腎上腺素、2 mmol/L L-谷氨酸以及1%抗生素液。所有的培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板預(yù)先在0.1%明膠溶液中于37 ℃孵育0.5 h。人骨髓MSC（由德國(guó)M.Haag博士贈(zèng)予）分離及鑒定方法見文獻(xiàn)［4］，DMEM培養(yǎng)基含10% FBS、2 mmol/L L-谷氨酸、1% HEPES、2 ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、1%抗生素液。HeLa細(xì)胞（購(gòu)自Invitrogen公司）的培養(yǎng)基為RPMI 1640培養(yǎng)基，其含10% FBS、1%抗生素液。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)CVB3基因拷貝數(shù)HL-1心肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合狀態(tài)后以每孔3×105個(gè)/L接種于6孔板中，MSC生長(zhǎng)至80%匯合狀態(tài)后以每孔2×105個(gè)/L接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后換成無血清培養(yǎng)基再培養(yǎng)1 h；分別將其分為未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組，其中感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組分別用CVB3感染4、12、24 h，未感染組僅用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h。分別收集HL-1心肌細(xì)胞及MSC，采用Trizol法分離RNA：首先應(yīng)用Trizol收集細(xì)胞，去除上清液后加入200 μl氯仿，室溫孵育15 s，4 ℃下13 200 r/m離心15 min（離心半徑11 cm），將上層透明的液體轉(zhuǎn)移至500 μl的異丙醇中，室溫孵育10 min，4 ℃下13 200 r/m離心15 min（離心半徑11 cm），用70%乙醇沖洗沉淀物，4 ℃下7 500 r/m離心15 min（離心半徑11 cm），最后將沉淀物溶于100 μl不含RNA酶的水中。應(yīng)用大容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成基因組DNA?？偡磻?yīng)體積為25.0 μl，其中含上游引物及下游引物各1.0 μl、SYBR green定量PCR預(yù)混液12.5 μl、無菌去離子水 5.5 μl、基因組 DNA 或標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒 5.0 μl。PCR反應(yīng)條件：50 ℃激活2 min，95 ℃激活10 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，最后1個(gè)循環(huán)完成后進(jìn)行95 ℃ 15 s及55 ℃ 15 s的孵育。應(yīng)用核糖體蛋白L32作為內(nèi)參照。引物設(shè)計(jì)：鼠核糖體蛋白L32的上游引物為5'-TGCCCACGGAGGACTGACA-3'，下游引物為5'-AGGTGCTGGGAGCTGCTACA-3'；人核糖體蛋白L32的上游引物為5'-AGGAGAGACACCGTCTGAACAAG-3'，下游引物為5'-GAACCAGGATGGTCGCTTTC-3'；CVB3的上游引物為5'-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3'，下游引物為5'-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3'。反應(yīng)在7900HT快速實(shí)時(shí)PCR儀中進(jìn)行，用96孔PCR板，每板上設(shè)核糖體蛋白L32及CVB3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒組、樣品組及陰性對(duì)照組，檢測(cè)達(dá)到設(shè)定的熒光強(qiáng)度時(shí)所進(jìn)行的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)（CT值）。根據(jù)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果，得到拷貝數(shù)-CT值標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)每份標(biāo)本的CT值與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較結(jié)果確定標(biāo)本所含的CVB3基因拷貝數(shù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 MTS法檢測(cè)細(xì)胞活性 HL-1心肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合狀態(tài)后以每孔3×105個(gè)/L接種于6孔板中，MSC生長(zhǎng)至80%匯合狀態(tài)后以每孔2×105個(gè)/L接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后換成無血清培養(yǎng)基再培養(yǎng)1 h；分別將其分為未感染組、感染組，其中感染組用CVB3感染，未感染組僅用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h。分別應(yīng)用CellTiter 96?AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。將10 000個(gè)細(xì)胞（HL-1心肌細(xì)胞及MSC）分別接種到96孔板，每孔體積100 μl。培養(yǎng)24 h后，將20 μl CellTiter 96?AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑直接加入培養(yǎng)細(xì)胞，孵育2 h后，選擇490 nm波長(zhǎng)，在VersaMax讀板機(jī)上測(cè)定各孔吸光度，即細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度 HL-1心肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合狀態(tài)后以每孔3×105個(gè)/L接種于6孔板中（HL-1心肌細(xì)胞組），MSC生長(zhǎng)至80%匯合狀態(tài)后以每孔2×105個(gè)/L接種于6孔板中（MSC組），培養(yǎng)24 h后換成無血清培養(yǎng)基再培養(yǎng)1 h，用CVB3感染。配備瓊脂溶液（含0.04% FBS的MEM2×培養(yǎng)基及1.3%純化瓊脂）備用，將CVB3感染后的HL-1心肌細(xì)胞、MSC的培養(yǎng)上清液分別稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6個(gè)/L備用。將HeLa細(xì)胞以每孔6×105個(gè)/L接種到6孔板，培養(yǎng)24 h，PBS沖洗2次后分別加入1 ml不同濃度的CVB3感染后的HL-1心肌細(xì)胞、MSC的培養(yǎng)上清液，37 ℃培養(yǎng)30 min，每孔加入2 ml瓊脂溶液，在超凈臺(tái)上放至瓊脂凝固，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，讀取瓊脂上病毒空斑數(shù)，即病毒滴度。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

表1 HL-1心肌細(xì)胞未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數(shù)比較（±s，n=6）Table 1 Comparisons of CVB3 genome copy number among the non-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group，4-hour-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group，12-hour-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group，and 24-hour-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group

表1 HL-1心肌細(xì)胞未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數(shù)比較（±s，n=6）Table 1 Comparisons of CVB3 genome copy number among the non-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group，4-hour-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group，12-hour-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group，and 24-hour-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group

注：CVB3=柯薩奇B3病毒

組別 CVB3基因拷貝數(shù)未感染組 0感染后4 h組 9 025±1 360感染后12 h組 25 875±1 359感染后24 h組 197 500±8 539 F值 1 563.90 P值 ＜0.01

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CVB3基因拷貝數(shù) HL-1心肌細(xì)胞未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。MSC未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表2 MSC未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數(shù)比較（±s，n=6）Table 2 Comparisons of the mean CVB3 genome copy number among non-CVB3-infected MSCs group，4-hour-CVB3-infected MSCs group，12-hour-CVB3-infected MSCs group，and 24-hour-CVB3-infected MSCs group

表2 MSC未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數(shù)比較（±s，n=6）Table 2 Comparisons of the mean CVB3 genome copy number among non-CVB3-infected MSCs group，4-hour-CVB3-infected MSCs group，12-hour-CVB3-infected MSCs group，and 24-hour-CVB3-infected MSCs group

組別 CVB3基因拷貝數(shù)未感染組 0感染后4 h組 1 037±114感染后12 h組 1 110±103感染后24 h組 190±31 F值 682.08 P值 ＜0.01

2.2 細(xì)胞活性 HL-1心肌細(xì)胞感染組感染后4、12、24 h細(xì)胞活性小于HL-1心肌細(xì)胞未感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HL-1心肌細(xì)胞未感染組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HL-1心肌細(xì)胞感染組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

表3 HL-1心肌細(xì)胞未感染組、感染組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性比較（ ±s，n=6）Table 3 Comparison of the mean cell viability between non-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group and CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group at different time points

表3 HL-1心肌細(xì)胞未感染組、感染組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性比較（ ±s，n=6）Table 3 Comparison of the mean cell viability between non-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group and CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group at different time points

組別 感染后4 h 感染后12 h感染后24 h F值 P值未感染組 2.15±0.04 2.22±0.14 2.10±0.08 3.20 0.07感染組 1.73±0.08 1.40±0.05 1.25±0.06 250.39 ＜0.01 t值 10.94 16.18 27.86 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

MSC未感染組與MSC感染組感染后4、12、24 h細(xì)胞活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。MSC未感染組、感染組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表4）。

表4 MSC未感染組、感染組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性比較（±s，n=6）Table 4 Comparison of the mean cell viability between non-CVB3-infected MSCs group and CVB3-infected MSCs group at different time points

表4 MSC未感染組、感染組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性比較（±s，n=6）Table 4 Comparison of the mean cell viability between non-CVB3-infected MSCs group and CVB3-infected MSCs group at different time points

組別 感染后4 h 感染后12 h感染后24 h F值 P值未感染組 1.29±0.03 1.35±0.05 1.43±0.02 21.25 ＜0.01感染組 1.49±0.11 1.29±0.05 1.36±0.04 19.73 ＜0.01 t值 0.01 0.05 0.19 P值 0.91 0.83 0.68

2.3 病毒滴度 HL-1心肌細(xì)胞組病毒滴度大于MSC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表5）。

3 討論

MSC是一組成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能，能自我復(fù)制且擴(kuò)增迅速，同時(shí)具有低免疫原性等特點(diǎn)。隨著MSC相關(guān)技術(shù)的日益成熟，其越來越多地被應(yīng)用于急性心肌梗死［4］及慢性心力衰竭［5］的臨床試驗(yàn)中。TELUKUNTLA等［6］于急性心肌梗死患者發(fā)病10 d內(nèi)通過靜脈注射MSC發(fā)現(xiàn)，患者心律失常發(fā)生率降低且左心室射血分?jǐn)?shù)明顯改善，同時(shí)療效可持續(xù)至發(fā)病后6個(gè)月。HARE等［7］通過心外膜注射自體MSC或外源性MSC發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者的左心室重構(gòu)及心肌瘢痕的形成均明顯改善。HAMSHERE等［8］研究發(fā)現(xiàn)，外周靜脈應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）聯(lián)合冠狀動(dòng)脈內(nèi)應(yīng)用MSC可明顯改善DCM患者的紐約心臟病協(xié)會(huì)（NYHA）分級(jí)及運(yùn)動(dòng)耐量，指出利用MSC進(jìn)行細(xì)胞移植或可望成為DCM心功能不全新的治療手段。而MARTIRE等［9］研究表明，MSC釋放腫瘤壞死因子（TNF）受體抑制劑，其可以通過抑制核因子-κBp65途徑的激活，改善DCM大鼠的組織重構(gòu)和增加左心室射血分?jǐn)?shù)。心肌炎患者遠(yuǎn)期可進(jìn)展為DCM，而MSC可否應(yīng)用于病毒性心肌炎患者目前尚不清楚。為此，本研究探討病毒性心肌炎主要致病病毒——CVB3感染對(duì)HL-1心肌細(xì)胞及MSC的影響。

表5 HL-1心肌細(xì)胞組與MSC組病毒滴度比較（±s，n=6）Table 5 Comparison of the mean viral titer between CVB3-infected groups of HL-1 cardiomyocytes and MSCs

表5 HL-1心肌細(xì)胞組與MSC組病毒滴度比較（±s，n=6）Table 5 Comparison of the mean viral titer between CVB3-infected groups of HL-1 cardiomyocytes and MSCs

注：MSC=間充質(zhì)干細(xì)胞

組別 病毒滴度（pfu./ml）HL-1心肌細(xì)胞組 161±6 000 MSC組 0 t值 123.048 P值 ＜0.01

CVB3是單股正鏈RNA病毒，具有mRNA活性和感染性。其生命周期是利用宿主細(xì)胞內(nèi)的代謝工具來完成自身的拷貝及病毒組裝，首先，病毒衣殼蛋白與宿主細(xì)胞表面特定受體之間發(fā)生特異性結(jié)合，然后，通過受體介導(dǎo)的胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞，緊接著，病毒在細(xì)胞內(nèi)完成復(fù)制及病毒蛋白的合成，最終，通過細(xì)胞裂解而釋放出來進(jìn)入下一個(gè)生命周期［10］。已有研究表明，MSC能夠降低CVB3感染小鼠的心肌細(xì)胞凋亡率及壞死率，抑制TNF的表達(dá)和單核細(xì)胞的激活，從而改善心肌收縮、舒張功能［11］。而且，與成纖維細(xì)胞相比，MSC可通過降低CVB3感染的野生型大鼠TNF-α、白介素1β和白介素6等，改善大鼠左心功能異常情況［12］。本研究結(jié)果顯示，HL-1心肌細(xì)胞未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數(shù)有差異，MSC未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數(shù)有差異；HL-1心肌細(xì)胞感染組感染后4、12、24 h細(xì)胞活性小于HL-1心肌細(xì)胞未感染組，HL-1心肌細(xì)胞未感染組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性無差異，HL-1心肌細(xì)胞感染組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性有差異；MSC未感染組與MSC感染組感染后4、12、24 h細(xì)胞活性無差異，MSC未感染組、感染組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性有差異；HL-1心肌細(xì)胞組病毒滴度大于MSC組；說明CVB3能夠在HL-1心肌細(xì)胞中復(fù)制，但不能在MSC中復(fù)制，這可能與MSC中缺乏柯薩奇腺病毒受體（CAR）的表達(dá)［13］、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2（ERK1/2）和蛋白激酶B（PKB）的激活［14］、泛素蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）有關(guān)［15］。

本研究組設(shè)想，以后可通過CVB3不能在MSC中復(fù)制的特點(diǎn)，利用MSC自身的免疫調(diào)節(jié)作用及旁分泌效應(yīng)［16］，將HL-1心肌細(xì)胞與MSC共同培養(yǎng)，觀察CVB3感染后的HL-1心肌細(xì)胞的病毒復(fù)制、細(xì)胞活性及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中病毒滴度，試圖尋找新的心肌炎的治療措施。本研究不足之處在于僅完成了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)部分，如果同時(shí)結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可能更具有說服力。

綜上所述，CVB3能夠在HL-1心肌細(xì)胞中復(fù)制，感染CVB3后HL-1心肌細(xì)胞活性降低；但CVB3不能在MSC中復(fù)制，且感染CVB3后MSC細(xì)胞活性并未明顯改變。提示可以根據(jù)MSC的這個(gè)特點(diǎn)將其進(jìn)一步應(yīng)用于急性心肌炎的治療中。

作者貢獻(xiàn)：彭俊負(fù)責(zé)本研究實(shí)施以及論文撰寫，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)；魏文娟、錢正明、黃建振、高世龍參與資料的收集與整理；張召才負(fù)責(zé)本研究的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，論文的修改，并進(jìn)行審校與質(zhì)量控制。

本文無利益沖突。