銀杏葉提取物對(duì)氯吡格雷人體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)影響

汪冬吟，黃秋玲，陳麗鳳，陳志民

銀杏葉主要含黃酮類、酚酸類等化合物，其藥理作用為抗氧化、清除自由基、增加血流量及神經(jīng)保護(hù)等[1-3]。氯吡格雷是腺苷二磷酸受體的一種抑制藥，能抑制血小板的相互聚集[4]，是臨床常用抗血小板聚集藥物之一。然而，氯吡格雷是僅有15%在肝臟CYP450 酶作用下轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物，而其余轉(zhuǎn)化為非活性代謝產(chǎn)物氯吡格(SR-26334)，發(fā)揮藥理作用[5]。實(shí)驗(yàn)室以大鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)銀杏葉片對(duì)氯吡格雷的生物利用度和吸收總量具有顯著的增強(qiáng)作用，兩藥合用對(duì)心臟功能有顯著的改善作用[6，7]。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)在藥物的吸收、分布和排泄等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，藥物可通過(guò)抑制P-gp功能影響藥物吸收或利用度等[8]。因此，本研究建立體外Caco-2 細(xì)胞模型，經(jīng)過(guò)具有熒光性質(zhì)的P-gp底物羅丹明-123(Rhodamine 123，Rho-123 )和各藥物單獨(dú)或聯(lián)合處理，測(cè)定各組熒光強(qiáng)度變化，評(píng)價(jià)各藥對(duì)P-gp功能的影響，從而對(duì)其相關(guān)機(jī)制研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取14名男性健康受試者，年齡20～23歲，體重60～63 kg；入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)無(wú)藥物過(guò)敏史、藥物依賴史、慢病史，無(wú)煙、酒嗜好；(2)血壓、脈搏等生命體征檢查均正常，心電圖檢查及血、尿常規(guī)和肝、腎功能等檢查均在正常值范圍；(3)近兩周內(nèi)，未服用過(guò)影響本研究吸收、代謝的藥物；(4)均簽署知情同意書。試驗(yàn)期間受試者統(tǒng)一清淡飲食，并聘請(qǐng)一名具有GCP結(jié)業(yè)證書的主治醫(yī)師與2名具有多年工作經(jīng)驗(yàn)的護(hù)士進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察藥物的不良反應(yīng)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 銀杏葉片(購(gòu)于江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：160804)，硫酸氫氯吡格雷(購(gòu)于賽諾菲制藥有限公司，批號(hào)：20160104)；SR26334 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(由深圳信立泰制藥有限公司提供，純度為99.2%)。維拉帕米鹽酸鹽、Rho-123、二甲基亞砜均購(gòu)于sigma。Mettler電子天平、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、渦旋混合器、島津LC-20A(配置自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)和二極管陣列檢測(cè)器；島津，日本)、XW-80A型微型渦旋混合儀(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。Millipore流式細(xì)胞儀(北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司)。Caco-2細(xì)胞株，由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方案 受試者在第1階段單獨(dú)服用氯吡格雷150 mg/d(75 mg/片)，之后經(jīng)過(guò)14 d洗脫期；第2段連續(xù)服用銀杏葉片240 mg/ d(60 mg/粒膠囊)14 d，第14天服用銀杏葉片1 h后，所有受試者空腹服用氯吡格雷；分別在第1階段和第2階段服用氯吡格雷后采集受試者0、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、24 h外周靜脈血，分離血漿待測(cè)。服藥后受試者均在觀察室內(nèi)休息，避免劇烈運(yùn)動(dòng)和長(zhǎng)時(shí)間臥床等影響受試者安全與健康的行為。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB-C18(2.1 mm×50 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相為乙腈∶水∶0.1% TFA=24∶56∶20(體積比)；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm和280 nm；流速為1.0 ml/min；柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：10 μl。

1.2.4 樣品預(yù)處理方法 采集不同時(shí)間段的血液于肝素抗凝管中，離心10 min，取上清，-20 ℃保存，待測(cè)。精密吸取待測(cè)血漿樣品200 ml，3000 r/min離心5 min，取100 ml上清，加10 μl的莫西沙星內(nèi)標(biāo)工作液(濃度為400 mg/L)，再加入10 μl的70%高氯酸，渦旋混勻，13 000 r/min離心5 min，取上清，進(jìn)液相檢測(cè)。另同法制備空白血漿和空白血漿+ SR26334標(biāo)準(zhǔn)品+莫西沙星內(nèi)標(biāo)樣品，進(jìn)液相檢測(cè)，計(jì)算不同時(shí)間受試者血藥濃度。

1.2.5 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 向空白血漿中，加入不同濃度的SR26334 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制成濃度相當(dāng)于0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/ml的血漿樣品，并按上述血漿樣品處理方式進(jìn)行處理之后進(jìn)液相檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 精密度、回收率及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) (1)精密度考察：制備SR26334濃度為20、1000、4000 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)品血漿溶液，處理方法同“2.3”項(xiàng)下，同一天內(nèi)不同時(shí)間處理樣品并測(cè)定5次，考察日內(nèi)精密度。處理方法同日內(nèi)，連續(xù)5 d，每天同一時(shí)間測(cè)定1次，考察日間精密度。(2)回收率考察：制備SR26334血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為20、1000、4000 μg/ml，處理方法同“2.3”項(xiàng)下，按照“2.4”項(xiàng)下所得標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的SR26334濃度與加入的已知濃度相比，計(jì)算相對(duì)回收率。另用甲醇配制上述濃度對(duì)照品，不經(jīng)血漿樣品處理直接進(jìn)樣計(jì)算SR26334與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為標(biāo)準(zhǔn)，與經(jīng)過(guò)血漿樣品處理所得樣品峰與內(nèi)標(biāo)峰面積比作比較，得絕對(duì)回收率。(3)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：制備SR26334血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為20、1000、4000 μg/ml，處理方法同“2.3”項(xiàng)下。分別在室溫放置24 h、凍-融3次、長(zhǎng)期凍存7 d，測(cè)定RSD。

1.2.7 銀杏葉提取物和氯吡格雷對(duì)P-gp功能的影響 參考文獻(xiàn)[9]方法，培養(yǎng)細(xì)胞并建立Caco-2細(xì)胞模型。用0.25%的胰蛋白酶處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2，離心，用PBS制備細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106count/ml。取0.5 ml細(xì)胞懸液，離心，去掉上清，再通過(guò)不同的藥物(表1)進(jìn)行處理后，于37 ℃、含5%的CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h，之后冰上終止處理。于4 ℃，1000 r/min，離心5 min，棄上清，用冰PBS洗滌兩次，加入2 μg/ml Rho-123或PBS，于37 ℃、含5%的CO2的培養(yǎng)箱中，孵育1 h后，冰上終止轉(zhuǎn)運(yùn)。4 ℃，1000 r/min，離心5 min，棄上清，加冰PBS洗滌2次，加PBS重懸。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞檢測(cè)Rho-123熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488 nm和535 nm，各組熒光強(qiáng)度用其對(duì)照熒光強(qiáng)度校正，每個(gè)濃度分別重復(fù)3次。

表1 銀杏葉提取物對(duì)氯吡格雷人體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)的分組與給藥情況

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 藥-時(shí)曲線數(shù)據(jù)用Drug And Statistics of Windows 2.0(DAS 2.0)軟件處理；采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 方法專屬性 在給定的色譜環(huán)境下，空白血漿、標(biāo)準(zhǔn)加樣血漿和聯(lián)合用藥2 h 的血漿樣品色譜見(jiàn)圖1。在本研究條件下，氯吡格雷酸及內(nèi)標(biāo)非那西汀色譜分離良好，內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間為5.6 min，氯吡格雷酸保留時(shí)間為9.2 min(圖1)。

圖1 人體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)氯吡格雷酸及內(nèi)標(biāo)非那西汀血漿色譜

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 根據(jù)血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線所測(cè)結(jié)果，得回歸方程為：Y= 0.512X+ 0.0314(R2 =0.9996)。結(jié)果表明，血漿中氯吡格雷酸在0.5～50 μg/ml 濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。

2.3 精密度、回收率及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 日內(nèi)精密度為4.25%，日間精密度4.33,均小于6%。相對(duì)回收率(98.22%)在89.66%～101.77%，絕對(duì)回收率(97.23%)88.34%～98.88%。樣品室溫放置24 h、凍-融循環(huán)3 次和長(zhǎng)期凍存14 d測(cè)定RSD分別為8.55%、8.48%、8.89%，均小于15%，提示氯吡格雷酸在血漿中穩(wěn)定，即滿足測(cè)定要求。

2.4 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

2.4.1 藥時(shí)曲線 給藥后分別于0.09，0.5，1，2，3，4，5，6，8，10，12，24 h取血處理，用HPLC 法測(cè)得不同時(shí)間的SR26334血漿藥物濃度，繪制藥時(shí)曲線。兩組SR26334 平均血藥濃度-時(shí)間曲線比較，結(jié)果表明聯(lián)合用藥組SR26334的血漿峰值和曲線下面積高于單獨(dú)用藥組，即單獨(dú)用藥組清除率快于聯(lián)合用藥組(圖2)。

圖2 兩組人體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)SR26334平均血藥濃度-時(shí)間曲線

2.4.2 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 通過(guò)DAS軟件處理SR26334的血漿濃度，用非房室模型估算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：血漿藥物峰值濃度(Cmax)、達(dá)峰時(shí)間(Tmax)、半衰期(T1/2)、清除率(CL/F)；兩組的AUC(0-t)、AUC(0-∞)、Cmax經(jīng)對(duì)數(shù)化處理， T1/2和CL/F采用DAS統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。結(jié)果表明與單獨(dú)用藥組相比，聯(lián)合用藥組中SR26334的AUC(0-t)、AUC(0-∞)和Cmax值均顯著降低(P<0.05,表2)，而CL/F顯著升高(P<0.05)，Tmax、t1/2z差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 氯吡格雷酸的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù) ±s)

注：聯(lián)合用藥組與單獨(dú)用藥組比較,①P<0.05

2.5 銀杏葉提取物和氯吡格雷對(duì)P-gp功能的影響 與羅丹明組相比，不同濃度的氯吡格雷組熒光強(qiáng)度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而不同濃度的銀杏葉提取物組中，高劑量銀杏葉提取物組熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.05，表3)。同時(shí)結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量的銀杏葉提取物和高劑量氯吡格雷聯(lián)合用藥即聯(lián)合用藥組熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.05)。

表3 各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果 ±s)

注：聯(lián)合用藥組中氯吡格雷組和銀杏葉提取物組均為100 μg/ml。與羅丹明組比較，①P<0.05

3 討 論

銀杏葉是臨床常用的中草藥，主要含黃酮類、酚酸類等化合物，其藥理作用為抗氧化、清除自由基、增加血流量及神經(jīng)保護(hù)等[1]。氯吡格雷常常聯(lián)合用藥，有研究通過(guò)對(duì)氯吡格雷聯(lián)合阿托伐他汀鈣用于TIA患者發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥效果明顯優(yōu)于單用氯吡格雷[7-10]；文獻(xiàn)[11]通過(guò)觀察氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林治療穩(wěn)定型心絞痛伴糖尿病的臨床的療效，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥具有更好的療效。目前研究表明氯吡格雷與銀杏葉片兩藥合用具有較好的療效，如對(duì)心臟功能具有顯著的作用[6]；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥影響其生物利用，如長(zhǎng)期用銀杏葉提取物對(duì)氯吡格雷生物利用度和吸收總量有一定影響[7]。然而目前對(duì)于人體內(nèi)兩者代謝相互作用未見(jiàn)研究報(bào)道。研究表明氯吡格雷在肝臟CYP450 酶作用下僅有15%左右轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物，而其余轉(zhuǎn)化為非活性代謝產(chǎn)物SR-26334，發(fā)揮藥理作用[5]。從而得出SR26334是氯吡格雷的主要代謝物，故通過(guò)檢測(cè)SR26334濃度觀察氯吡格雷機(jī)內(nèi)的代謝變化。本研究通過(guò)銀杏葉提取物對(duì)人體內(nèi)氯吡格雷藥動(dòng)學(xué)影響，將實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)階段，單獨(dú)服用氯吡格雷和連續(xù)服用銀杏葉提取物后繼而服用氯吡格雷，對(duì)比服用銀杏葉提取物前后體內(nèi)血中SR26334相關(guān)藥代參數(shù)，以期為臨床銀杏葉提取物和氯吡格雷的聯(lián)合用藥提供理論依據(jù)。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)期服用銀杏葉片有助于提高氯吡格雷在人體內(nèi)的利用度和吸收總量。

藥物代謝主要肝臟中進(jìn)行，在此過(guò)程中CYP450起著至關(guān)重要的作用，其中最重要的是CYP3A亞族。然而研究表明CYP3A酶系與P-gp具有相同的組織分布和底物。P-糖蛋白(P-gp)是一種轉(zhuǎn)運(yùn)藥物分子進(jìn)出細(xì)胞的外排蛋白，在動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在，在器官和正常組織如腎臟、肝臟及腸道等中有著豐富的表達(dá)[12]。研究表明銀杏葉片中槲皮素、山奈酚等黃酮類化合物對(duì)P-gp功能具有抑制作用，它也可通過(guò)與外排轉(zhuǎn)運(yùn)體和代謝酶的相互作用而影響底物的吸收[13，14]。在體內(nèi)，銀杏葉片和氯吡格雷均為P-gp的底物，并且影響氯吡格雷在十二指腸吸收的主要因素也是P-gp。因此我們進(jìn)一步進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，以期研究相關(guān)機(jī)制。目前人結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)常用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究[15]。本研究通過(guò)建立體外模型，研究銀杏葉提取物和氯吡格雷對(duì)P-gp的作用，結(jié)果表明氯吡格雷組熒光強(qiáng)度無(wú)顯著變化，而銀杏葉提取物組和聯(lián)合用藥組熒光強(qiáng)度顯著升高，即表明單用氯吡格雷時(shí)對(duì)P-gp無(wú)顯著抑制作用，而單用銀杏葉提取物或聯(lián)合氯吡格雷用藥呈現(xiàn)明顯的抑制作用，該結(jié)果提示銀杏葉提取物對(duì)P-gp有較強(qiáng)的抑制作用。結(jié)合我們前期藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推測(cè)長(zhǎng)期服用銀杏葉片能增加氯吡格雷在人體內(nèi)的吸收總量，氯吡格雷在人體內(nèi)吸收總量的增加可能與銀杏葉片對(duì)P-gp的抑制有關(guān)。

綜上所述，本文研究銀杏葉提取物對(duì)人體內(nèi)氯吡格雷藥動(dòng)學(xué)影響，結(jié)果表明相關(guān)機(jī)制可能是銀杏葉提取物抑制P-gp的功能導(dǎo)致，這對(duì)臨床用藥具有一定的指導(dǎo)意義。但本研究還存在一定的局限性，對(duì)相關(guān)機(jī)制研究?jī)H局限于體外細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)銀杏葉片對(duì)P-gp抑制的作用，并未闡明其是否在人體內(nèi)具有抑制作用，有待進(jìn)一步研究。