脯氨酸引發(fā)提高煙草種子和幼苗抗逆性及其與抗氧化系統(tǒng)的關(guān)系

BOUDMYXAY Khampheng，沈 鐳 ，鐘 帥 ，孫艷芝 ，楊慧芹

（1.中國(guó)科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所，北京100101；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院，云南昆明650500）

植物在自然環(huán)境中會(huì)受到各種因子影響，如干旱、低溫、高溫、高鹽等。不良環(huán)境作用于植物，將會(huì)引發(fā)植物體內(nèi)一系列生理代謝反應(yīng)，表現(xiàn)為生長(zhǎng)和代謝受到抑制，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致植株死亡，造成不可逆的傷害[1]。干旱和低溫對(duì)世界植物產(chǎn)量的影響，在眾多逆境因子中占首位，其危害程度相當(dāng)于其他自然災(zāi)害之和[2]。

干旱和低溫是影響植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)重要逆境[3]。前人研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下糜子的光合色素含量和葉片MDA含量明顯升高[4]；在干旱脅迫下的木荷幼苗游離脯氨酸和MDA含量有所上升，抗旱性?xún)?yōu)良[5]；隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，番茄葉片MDA，DHA，ASA含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，同時(shí)APX活性也有顯著升高[6]；在250 mmol/L NaCl脅迫下，加工番茄幼苗的MDA含量降低[7]。抗壞血酸（AsA）是一種普遍存在于植物組織的抗氧化物質(zhì)，在活細(xì)胞中，抗壞血酸氧化還原系統(tǒng)由還原型的AsA和脫氫抗壞血酸（DHA）組成。AsA的氧化還原狀態(tài)反映了植物細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的氧化還原狀況，當(dāng)遭遇逆境脅迫時(shí)，AsA/DHA比率、相關(guān)代謝物和酶類(lèi)會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化物酶（GPX）廣泛存在于各種動(dòng)、植物細(xì)胞中，它利用愈創(chuàng)木酚為電子供體清除H2O2。GPX存在于細(xì)胞的各個(gè)部位，它與SOD，CAT等酶類(lèi)密切配合，相互協(xié)調(diào)清除植物體內(nèi)過(guò)多的自由基，提高植物的抗逆性[6，8]。

盡管種子引發(fā)技術(shù)目前已在多種植物種類(lèi)中得到成功應(yīng)用，但在不同物種甚至同種不同批次的種子中，引發(fā)效果往往受到引發(fā)劑種類(lèi)的影響。脯氨酸（Proline）是植物中主要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，許多植物在受到逆境脅迫時(shí)都能大量積累脯氨酸，對(duì)細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)起重要作用，是植物體的防脫水良劑[9-10]。在干旱條件下，脯氨酸能維持滲透平衡和膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，起到調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)和清除活性氧的作用[11]，同時(shí)也能中和干旱脅迫產(chǎn)生的氨，起到解毒作用，還可作為復(fù)水后植物直接利用的氮源[12]。目前，尚未有關(guān)于脯氨酸引發(fā)提高煙草種子和幼苗抗逆性及其與抗氧化系統(tǒng)關(guān)系的報(bào)道。

本試驗(yàn)選100 mmol/L濃度的脯氨酸引發(fā)，研究其對(duì)常溫條件、干旱、低溫和干旱+低溫交叉脅迫下煙草種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響，并深入了解抗氧化系統(tǒng)在脯氨酸引發(fā)提高煙草種子及幼苗抗逆性中的作用，期望從研究中獲得有用信息，為提高煙草種子及幼苗的抗逆性提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為云煙203裸種，由玉溪中煙種子有限責(zé)任公司提供。

1.2 種子引發(fā)處理

煙草種子以0.5%NaClO消毒5 min后，用蒸餾水漂洗干凈，放于100mmol/L的Pro溶液中，在26℃黑暗條件下引發(fā)24 h。引發(fā)結(jié)束后，用蒸餾水快速?zèng)_洗種子，吸干表面水分，26℃下回干到原始含水量，于低溫低濕貯藏柜中保存?zhèn)溆?。未引發(fā)的干種子（萌發(fā)前用0.5%NaClO進(jìn)行表面消毒）記為對(duì)照 1（CK1），蒸餾水引發(fā)作為對(duì)照 2（CK2）。

1.3 種子萌發(fā)試驗(yàn)

1.3.1 種子在正常培養(yǎng)條件下的萌發(fā)試驗(yàn) 將Pro引發(fā)的種子、未引發(fā)的干種子（CK1）及蒸餾水引發(fā)的種子（CK2）置于下鋪1層海綿、上墊2張濾紙的直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中用播種器均勻播種100粒種子，加蓋培養(yǎng)，發(fā)芽期間用自來(lái)水保持濾紙濕潤(rùn)。在26℃、空氣相對(duì)濕度75%的人工氣候箱中萌發(fā)，每天光照12 h（正常培養(yǎng)）。在第8，10，12，14，16 天測(cè)定幼苗的抗氧化系統(tǒng)。

1.3.2 種子在干旱脅迫條件下的萌發(fā)試驗(yàn) 以30%（W/V）PEG—6000作為模擬干旱脅迫條件。正常培養(yǎng)至第8天，然后換用30%的PEG—6000溶液浸潤(rùn)培養(yǎng)，處理2，4 d；處理4 d后恢復(fù)為用自來(lái)水培養(yǎng)2，4 d。在第10，12天測(cè)定干旱處理的抗氧化系統(tǒng)，第14，16天測(cè)定恢復(fù)處理的抗氧化系統(tǒng)。

1.3.3 種子在低溫脅迫條件下的萌發(fā)試驗(yàn) 正常培養(yǎng)至第8天，然后置于4℃下低溫脅迫處理培養(yǎng)2，4 d；處理4 d后恢復(fù)于26℃下培養(yǎng)2，4 d。在第10，12天測(cè)定低溫處理的抗氧化系統(tǒng)，第14，16天測(cè)定恢復(fù)處理的抗氧化系統(tǒng)。

1.3.4 種子在干旱＋低溫交叉脅迫條件下的萌發(fā)試驗(yàn) 以25%（W/V）PEG—6000作為模擬干旱＋低溫交叉脅迫條件。正常培養(yǎng)至第8天，然后換用25%的PEG—6000溶液浸潤(rùn)培養(yǎng)并于4℃下模擬干旱+低溫脅迫處理培養(yǎng)2，4 d；處理4 d后恢復(fù)為用自來(lái)水培養(yǎng)于26℃處理2，4 d。于第10，12天測(cè)定干旱+低溫交叉脅迫處理的抗氧化系統(tǒng)；第14，16天測(cè)定恢復(fù)處理的抗氧化系統(tǒng)。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 抗壞血酸過(guò)氧化物酶的測(cè)定 抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）的測(cè)定參照李忠光等[13]的方法進(jìn)行。反應(yīng)混合液為pH值7.0的Tris-HCl緩沖液，內(nèi)含0.1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L H2O2。測(cè)定時(shí)反應(yīng)混合液和30 mmol/L AsA先于25℃水浴鍋中預(yù)熱，在試管中加入反應(yīng)混合液2.9 mL，粗酶提取液50 μL，搖勻后調(diào)零，封口后于25℃水浴鍋中保溫5 min，然后加入AsA溶液50 μL，迅速混勻置于分光光度計(jì)中，每隔10 s讀出290 nm處吸光度的減少值。APX的活力以每分鐘消耗1 μmol AsA為一個(gè)酶活力單位來(lái)計(jì)算。

1.4.2 愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化物酶的測(cè)定 愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化物酶（GPX）的測(cè)定參照CHANCE等[14]和李忠光等[15]的方法進(jìn)行。反應(yīng)混合液為pH值7.0的Tris-HCl緩沖液，內(nèi)含0.1 mmol/L EDTA，10 mmol/L愈創(chuàng)木酚，5 mmol/L H2O2。測(cè)定時(shí)反應(yīng)混合液先于25℃水浴中預(yù)熱，然后在試管中加入反應(yīng)混合液2.95 mL，加入粗酶提取液50 μL，迅速混勻置于分光光度計(jì)中，每隔30 s讀出470 nm處吸光度的減小值，取3 min反應(yīng)時(shí)間來(lái)計(jì)算酶活。GPX的酶活力以每分鐘消耗1 μmol愈創(chuàng)木酚的酶量為一個(gè)酶活力單位來(lái)計(jì)算。

1.4.3 丙二醛含量的測(cè)定 丙二醛（MDA）含量的測(cè)定參考張志良等[16]的方法，并對(duì)其進(jìn)行了修改。具體步驟為：取0.2 g幼苗樣品于研缽中加入液氮研磨，然后加5%的三氯乙酸（TCA）10 mL充分研磨后轉(zhuǎn)入離心管中，用5 mL10%TCA清洗研缽，合并提取液并于4 000×g離心15 min。取2.0 mL上清液加入2.0 mL 0.25%硫代巴比妥酸（TBA）溶液（用10%TCA配制），100℃水浴鍋加熱30 min，冷卻后在450，450，600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

1.4.4 抗壞血酸和谷胱甘肽含量的測(cè)定

1.4.4.1 抗氧化劑的提取 抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）的提取是按照李忠光等[13]的方法，取樣品0.2g于研缽中，加入預(yù)冷的5%磺基水楊酸2.5mL和少許石英砂，置于冰上進(jìn)行充分研磨，轉(zhuǎn)入離心機(jī)于4℃下20 000×g離心20 min，將上清液分裝于-20℃保存或直接進(jìn)行抗氧化劑分析。

1.4.4.2 抗壞血酸含量的測(cè)定 AsA含量測(cè)定參照李忠光等[13]和JIANG等[17]的方法作如下修改：取上清液100 μL，加入20 μL1.84 mol/L三乙醇胺中和樣液，加入pH值7.5的50 mmol/L磷酸緩沖液（內(nèi)含2.5 mmol/LEDTA）250 mL，加入50 mmol/LDTT 50 μL，25℃保溫10 min，再加入0.5%乙基馬來(lái)酰亞胺50 μL，混勻后分別加入10%TCA，44%磷酸、4%雙吡啶（用70%乙醇配制）各200 μL，混勻后加入3%FeCl3100 μL，混勻于40℃水浴鍋中加熱1 h，在525 nm處讀出吸光度。還原型AsA的測(cè)定需把上述DTT和乙基馬來(lái)酰亞胺用等體積的蒸餾水代替即可，用5%磺基水楊酸為溶劑，采取同樣方法制作AsA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4.3 谷胱甘肽含量的測(cè)定 GSH含量的測(cè)定參照李忠光等[13]和NAGALASHMI等[18]的方法作如下修改：取上清液50μL，加入5%磺基水楊酸50μL，加入24μL1.84mol/L三乙醇胺中和樣液，加入50μL 10%乙烯吡啶（用70%乙醇配制），25℃水浴1 h，然后加入706mL50mmol/L磷酸緩沖液（內(nèi)含2.5mmol/L EDTA），再加入 20 μL10 mmol/LNADPH 和 80 μL 12.5 mmol/LDTNB（二硫硝基苯甲酸）混勻，于25℃保溫 10 min，之后加入 20 μL 50 U/mol GR，立即混勻后讀出3 min內(nèi)412 nm吸光度的變化值。上述方法為GSSG含量的測(cè)定，總谷胱甘肽含量（GSH＋GSSG）的測(cè)定將上述乙烯吡啶用等體積的蒸餾水代替即可，GSH含量用總谷胱甘肽含量（GSH＋GSSG）減去GSSG含量即可得出。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn)重復(fù)，每次獨(dú)立試驗(yàn)有3個(gè)平行重復(fù)，每個(gè)重復(fù)有100粒種子。試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，用Sigma plot 12.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 脯氨酸引發(fā)對(duì)煙草幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響

2.1.1 脯氨酸引發(fā)對(duì)干旱脅迫下煙草幼苗中APX和GPX活性的影響 圖1-A顯示，經(jīng)100 mmol/L Pro引發(fā)后，煙草幼苗APX活力高于對(duì)照。對(duì)培養(yǎng)至第8天的幼苗進(jìn)行脅迫處理，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，APX活力逐漸下降，明顯低于正常培養(yǎng)條件下各對(duì)照。但經(jīng)Pro引發(fā)的煙草幼苗APX活力仍顯著高于經(jīng)過(guò)脅迫的對(duì)照CK1和CK2；脅迫4 d后的煙草幼苗APX活力比經(jīng)過(guò)脅迫處理后的對(duì)照CK1和CK2分別高出711%和30%，恢復(fù)后的幼苗APX活力逐漸升高，恢復(fù)生長(zhǎng)4 d后APX活力比對(duì)照CK1和CK2分別高出383%和26%。從圖1-B可以看出，經(jīng)Pro引發(fā)后在正常條件的煙草幼苗GPX活力明顯高于CK1和CK2（分別高58%和18%）。在干旱脅迫過(guò)程中，GPX活力隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，明顯低于正常培養(yǎng)條件各對(duì)照；脅迫4 d后，經(jīng)Pro引發(fā)幼苗的GPX活性比經(jīng)過(guò)脅迫處理后的對(duì)照CK1和CK2分別高出173%和44%；對(duì)脅迫處理的幼苗進(jìn)行恢復(fù)，在恢復(fù)生長(zhǎng)過(guò)程中Pro引發(fā)的煙草幼苗GPX活力逐漸升高，恢復(fù)生長(zhǎng)4 d后，GPX活力比對(duì)照CK1和CK2分別明顯高出449%和116%（P＜0.05）。

2.1.2 脯氨酸引發(fā)對(duì)低溫脅迫下煙草幼苗中APX和GPX活性的影響 從圖2-A可以看出，在正常萌發(fā)條件下，經(jīng)Pro引發(fā)后的煙草幼苗APX活性明顯高于對(duì)照。對(duì)培養(yǎng)至第8天的煙草幼苗進(jìn)行低溫脅迫處理，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)APX活力逐漸下降。但經(jīng)Pro引發(fā)過(guò)的幼苗APX活力仍明顯高于經(jīng)過(guò)脅迫的對(duì)照CK1和CK2，低溫脅迫4 d后，APX活力比CK1和CK2分別高529%和33%；恢復(fù)生長(zhǎng)4 d后，APX活力達(dá)到最高，分別比CK1和CK2高出261%和35%（P＜0.05）。由圖2-B可知，經(jīng)Pro引發(fā)后的煙草幼苗GPX活力明顯高于對(duì)照，在低溫脅迫過(guò)程中GPX活力逐漸降低，但經(jīng)Pro引發(fā)過(guò)種子的幼苗APX活力仍明顯高于經(jīng)過(guò)脅迫的對(duì)照CK1和CK2；脅迫4 d后，幼苗的GPX比對(duì)照CK1和CK2分別高出218%和110%；對(duì)脅迫處理后的煙草幼苗進(jìn)行恢復(fù)，恢復(fù)4 d后，GPX活力明顯提高，Pro引發(fā)的幼苗GPX活性分別比對(duì)照CK1和CK2高296%和 97%（P＜0.05）。

2.1.3 脯氨酸引發(fā)對(duì)干旱＋低溫交叉脅迫下煙草幼苗中APX和GPX活性的影響 由圖3-A可知，在干旱＋低溫交叉脅迫下，煙草幼苗APX活性略有下降，但經(jīng)Pro引發(fā)過(guò)種子的幼苗APX活力仍明顯高于經(jīng)過(guò)脅迫的對(duì)照CK1和CK2，干旱＋低溫交叉脅迫4 d后，APX活力明顯提高，比經(jīng)過(guò)脅迫的對(duì)照CK1和CK2分別高出550%和27%?；謴?fù)后，APX活性繼續(xù)升高，恢復(fù)4 d后APX活力明顯高于對(duì)照，分別比對(duì)照CK1和CK2高出280%和30%。由圖3-B可知，在正常條件萌發(fā)條件下，經(jīng)Pro引發(fā)后的煙草幼苗GPX活力都明顯高于各對(duì)照。在干旱＋低溫交叉脅迫過(guò)程中GPX活力略有下降，在脅迫4 d后，經(jīng)Pro引發(fā)幼苗GPX比對(duì)照CK1和CK2分別高出175%和37%；對(duì)脅迫處理后的煙草幼苗進(jìn)行恢復(fù)，GPX活力逐漸升高，恢復(fù)4 d后，GPX活力比對(duì)照CK1和CK2分別高出192%和68%（P＜0.05）。

2.1.4 脯氨酸引發(fā)對(duì)干旱、低溫和干旱＋低溫交叉脅迫下煙草幼苗中MDA含量的影響 由圖4可知，在正常萌發(fā)條件下，經(jīng)脯氨酸引發(fā)后的煙草幼苗MDA含量比對(duì)照干種子和蒸餾水引發(fā)的種子分別低42%和21%（P＜0.05）。在受干旱、低溫和干旱＋低溫交叉脅迫時(shí)，煙草幼苗中MDA含量快速增加，但經(jīng)Pro引發(fā)的MDA含量仍低于對(duì)照。經(jīng)恢復(fù)生長(zhǎng)后，MDA含量逐漸降低。通過(guò)這些分析可知，用100 mmol/L Pro引發(fā)可以提高煙草幼苗在干旱、低溫和干旱＋低溫交叉脅迫環(huán)境中抗氧化酶活性。

2.2 脯氨酸引發(fā)對(duì)煙草幼苗中AsA含量變化的影響

2.2.1 脯氨酸引發(fā)對(duì)干旱脅迫下煙草幼苗中AsA含量的影響 AsA是一種普遍存在于植物組織中的高豐度小分子抗氧化物質(zhì)，它可以直接與ROS反應(yīng)，在植物抵抗氧化脅迫中具有重要作用[19]。在正常萌發(fā)條件下，經(jīng)Pro引發(fā)后的煙草幼苗AsA含量比對(duì)照 CK1和 CK2分別高 12.3%和 4.7%（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)干旱脅迫后煙草幼苗AsA含量均明顯低于各對(duì)照組，但經(jīng)Pro引發(fā)的煙草幼苗AsA含量仍明顯高于經(jīng)過(guò)脅迫的對(duì)照CK1和CK2。從圖5-A可以看出，經(jīng)干旱脅迫的煙草幼苗還原型抗壞血酸（AsA）的含量顯著增加，干旱脅迫4 d時(shí)，煙草幼苗的AsA含量逐漸降低，但經(jīng)Pro引發(fā)的ASA仍比對(duì)照CK1和CK2分別高出11.8%和6.4%。對(duì)脅迫處理4 d后的幼苗進(jìn)行恢復(fù)，恢復(fù)2 d后煙草幼苗的AsA含量逐漸升高，但恢復(fù)到4 d時(shí)，AsA含量又呈降低趨勢(shì)，但經(jīng)Pro引發(fā)的AsA含量仍比經(jīng)過(guò)脅迫的對(duì)照 CK1和 CK2分別高出16.1%和 6.7%（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)干旱脅迫的煙草幼苗氧化性抗壞血酸（DHA）和總抗壞血酸含量AsA＋DHA也隨之下降，但經(jīng)Pro引發(fā)的DHA，AsA＋DHA含量仍明顯高于經(jīng)過(guò)脅迫的對(duì)照CK1和CK2（圖5-B，C）。經(jīng)干旱脅迫2 d的煙草幼苗在遭遇后續(xù)干旱脅迫4 d時(shí)，AsA/（AsA＋DHA）明顯高于對(duì)照（圖5-D）；對(duì)幼苗恢復(fù)生長(zhǎng)4 d時(shí)，還原型抗壞血酸在總含量中的比值分別高出對(duì)照CK1和CK25.3%和1.4%。

2.2.2 脯氨酸引發(fā)對(duì)低溫脅迫下煙草幼苗中AsA含量的影響 從圖6-A可以看出，經(jīng)低溫脅迫的煙草幼苗AsA含量都明顯高于對(duì)照，并且4℃脅迫4 d時(shí)，Pro引發(fā)的作用效果明顯高于經(jīng)過(guò)脅迫的對(duì)照CK1和CK2。在低溫脅迫4 d后經(jīng)Pro引發(fā)的煙草幼苗AsA含量比CK1和CK2分別高出23%和9.3%；恢復(fù)生長(zhǎng)4 d后，AsA含量也高出CK1和CK233%和8.1%。此外，經(jīng)低溫脅迫的DHA含量和總含量也高出對(duì)照（圖6-B，C）。從圖6-D可以看出，低溫脅迫處理4 d后，煙草幼苗AsA/（AsA＋DHA）的值比CK1和CK2分別高出12%和2.9%；恢復(fù)生長(zhǎng)4d后，AsA/（AsA＋DHA）的值比對(duì)照CK1和CK2明顯高出 17%和 1.4%（P＜0.05）。

2.2.3 脯氨酸引發(fā)對(duì)干旱＋低溫交叉脅迫下煙草幼苗中AsA含量的影響 從圖7可以看出，經(jīng)干旱＋低溫交叉脅迫誘導(dǎo)，經(jīng)Pro引發(fā)的煙草幼苗AsA，DHA含量和總含量明顯高于對(duì)照（圖7-A，B，C）。干旱＋低溫交叉脅迫前，煙草幼苗還原型抗壞血酸在總含量中的比值A(chǔ)sA/（AsA＋DHA）最高（圖7-D）；干旱＋低溫交叉脅迫處理4 d時(shí)，經(jīng)Pro引發(fā)的煙草幼苗AsA/（AsA＋DHA）的值比CK1和CK2分別高出8.6%和2.9%，恢復(fù)生長(zhǎng)4 d時(shí)，AsA/（AsA＋DHA）的值比對(duì)照CK1和CK2分別高出8.6%和4.9%。

2.3 脯氨酸引發(fā)對(duì)煙草幼苗GSH含量變化的影響

2.3.1 脯氨酸引發(fā)對(duì)干旱脅迫下煙草幼苗中GSH含量變化的影響 GSH廣泛分布于哺乳動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞內(nèi)，是最主要的、含量最豐富的含巰基的低分子肽，它可以直接或間接與ROS反應(yīng)[20]。由圖8可知，在正常萌發(fā)條件下，經(jīng)100 mmol/L Pro引發(fā)后煙草幼苗GSH，SGH＋GSSG，GSSG含量比對(duì)照CK1和CK2高。經(jīng)干旱脅迫，Pro引發(fā)的煙草幼苗GSH，SGH＋GSSG和GSSG含量均明顯低于各對(duì)照組，但比經(jīng)過(guò)脅迫的對(duì)照CK1和CK2要高（圖8-A，B，C）。經(jīng)引發(fā)后的煙草種子在干旱脅迫下的GSH/（GSH＋GSSG）值明顯增大（圖8-D），經(jīng)干旱脅迫時(shí)煙草幼苗GSH/（GSH＋GSSG）值明顯高出各對(duì)照組。干旱脅迫處理4 d時(shí)，Pro引發(fā)的煙草幼苗GSH/（GSH＋GSSG）的值比經(jīng)過(guò)脅迫的對(duì)照CK1和CK2分別高出19%和8.1%（P＜0.05）；恢復(fù)生長(zhǎng)4d時(shí)，GSH/（GSH＋GSSG）的值明顯高出CK1和CK2（24.8%和5.7%），可以看出，100 mmol/LPro引發(fā)的煙草幼苗在干旱脅迫下還原性谷胱甘肽的含量明顯增加。

2.3.2 脯氨酸引發(fā)對(duì)低溫脅迫下煙草幼苗中GSH含量變化的影響 從圖9可以看出，經(jīng)低溫脅迫后煙草幼苗GSH，GSH＋GSSG，GSSG含量均明顯低于各對(duì)照組，但比 CK1和 CK2要高（圖 9-A，B，C）。經(jīng)100 mmol/L Pro引發(fā)的煙草幼苗在低溫脅迫下的 GSH/（GSH＋GSSG）值明顯提高（圖 9-D），高于各對(duì)照組。低溫脅迫處理4 d后，經(jīng)Pro引發(fā)的煙草幼苗GSH/（GSH＋GSSG）的值比經(jīng)過(guò)脅迫的對(duì)照CK1和 CK2分別高出 5.4%和 1.4%（P＜0.05）；恢復(fù)生長(zhǎng)4 d時(shí)，GSH/（GSH＋GSSG）的值比經(jīng)過(guò)脅迫的對(duì)照CK1和CK2分別高出8.7%和3.4%（P＜0.05），表明Pro引發(fā)能提高煙草幼苗在低溫脅迫下還原性谷胱甘肽的含量。

2.3.3 脯氨酸引發(fā)對(duì)干旱＋低溫交叉脅迫下煙草幼苗中GSH含量的影響 由圖10可知，在正常萌發(fā)條件下，經(jīng)Pro引發(fā)后煙草幼苗的谷胱甘肽含量比對(duì)照CK1和CK2高。經(jīng)干旱+低溫交叉脅迫的煙草幼苗谷胱甘肽含量均明顯低于各對(duì)照組，但經(jīng)Pro引發(fā)的煙草幼苗谷胱甘肽含量仍明顯高于經(jīng)過(guò)脅迫的對(duì)照CK1和CK2。分析結(jié)果說(shuō)明，100 mmol/L Pro引發(fā)能提高煙草幼苗在干旱+低溫交叉脅迫下的谷胱甘肽含量。

3 結(jié)論與討論

抗壞血酸和谷胱甘肽在活性氧脫毒過(guò)程中起重要作用，它們可直接同ROS反應(yīng)，將其還原；又可作為酶的底物，在活性氧的清除過(guò)程中扮演重要角色[2]?？箟难?、還原型谷胱甘肽及APX，GR，SOD和MDHAR都參與了植物細(xì)胞中抗氧化劑的再生過(guò)程?？箟难岬牡?種功能是在葉綠體類(lèi)囊體表面作為還原劑，參與抗壞血酸過(guò)氧化物酶介入的過(guò)氧化氫的清除，在這一過(guò)程中，抗壞血酸被氧化成單脫氫抗壞血酸。在完全氧化的脫氫抗壞血酸產(chǎn)生的情況下，還原型谷胱甘肽作為還原劑參與抗壞血酸的再生，產(chǎn)生的氧化型谷胱甘肽可以通過(guò)谷胱甘肽還原酶得到還原。由于抗壞血酸在清除活性氧的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，故而在葉綠體中，氧的攝入、APX的功能及分子氧還原等相關(guān)的過(guò)程都有其參與[2]。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在正常萌發(fā)條件下，用100 mmol/L Pro引發(fā)后，煙草幼苗抗氧化酶活性（APX和GPX）和抗氧化劑（AsA和GSH）都明顯高于對(duì)照。對(duì)煙草幼苗進(jìn)行干旱、低溫或干旱+低溫交叉脅迫處理，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，抗氧化酶活性逐漸降低，抗氧化劑含量逐漸下降，但經(jīng)Pro引發(fā)的煙草幼苗抗氧化酶活性和抗氧化劑含量仍明顯高于經(jīng)過(guò)脅迫的對(duì)照CK1和CK2。以上結(jié)果表明，Pro引發(fā)可明顯改善煙草幼苗抗氧化系統(tǒng)，包括抗氧化劑含量和抗氧化酶活性，使幼苗在干旱、低溫或干旱+低溫交叉脅迫下有較強(qiáng)的抗旱和抗寒性，抗氧化系統(tǒng)在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。

植物體內(nèi)的抗氧化酶活性越高，MDA含量越低[7，21]。煙草幼苗在干旱脅迫、低溫或干旱＋低溫交叉脅迫下，MDA含量快速增加，表明幼苗體內(nèi)細(xì)胞發(fā)生了膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，細(xì)胞膜的完整性受到破壞，但經(jīng)100 mmol/L Pro引發(fā)的煙草幼苗MDA含量明顯低于對(duì)照，說(shuō)明Pro引發(fā)在很大程度上減輕了逆境脅迫引起的傷害，提高了煙草的抗旱和抗旱能力。