食用植物油中3-MCPD酯GC-MS測定方法研究

王永瑞 王 丹 徐宇麗 魏長慶

(石河子大學(xué)食品學(xué)院1，石河子 832000)(新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室2，石河子 832000)(石河子出入境檢驗檢疫局3，石河子 832000)

新疆占中國1/6左右國土面積，地大物博，特產(chǎn)豐富，瓜果類農(nóng)產(chǎn)品更是享譽(yù)國內(nèi)外。近年來，利用新疆特有瓜果籽仁為原料生產(chǎn)的特種油脂不斷深入市場，并贏得廣大人民群眾的好評[1]。目前，新疆市場銷售的特種油脂有：紅花籽油、葡萄籽油、番茄籽油等多個種類。在植物油脂中，不同種類的脂肪酸、維生素以及不同的天然色素和微量元素對人體起著重要的作用，特種油脂因其脂肪酸組成的特殊性對各種類型體質(zhì)的人群起到不同的保健效果，越來越受到廣大消費者青睞[2]。然而近年來研究發(fā)現(xiàn)，在各類食用油以及油類食品中存在著一種潛在的致癌物質(zhì)—氯丙醇酯，這使得食用油的安全問題更加引人關(guān)注。

3-MCPD酯是4類氯丙醇酯中的1類，最早發(fā)現(xiàn)于1980年，由Velí?ek等[3]在用酸水解蔬菜蛋白過程中發(fā)現(xiàn)。隨著檢測設(shè)備以及檢測方法的發(fā)展，陸續(xù)有研究者在各類食品中檢測出3-MCPD酯的存在，如餅干、咖啡、薯條、魚油、食用油、嬰幼兒奶粉等中都有存在[4-9]。3-MCPD酯之所以備受關(guān)注，不僅僅是因為其作為一種非營養(yǎng)物質(zhì)的存在，而是因為其進(jìn)入人體后會被水解為游離的3-MCPD。這種物質(zhì)已知具有腎臟毒性，致癌性以及致突變等危害，世界各國對3-MCPD都有相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)[10-11]。2017年9月，隨著新的國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017《食品中污染物痕量》的正式實施，關(guān)于調(diào)味品中3-MCPD限量指標(biāo)也有著明確的規(guī)定。因此，本研究采用間接法將油樣中的3-MCPD酯經(jīng)過甲醇鈉-甲醇堿水解為3-MCPD，再固相萃取柱凈化，七氟丁酰咪唑(HFBI)衍生結(jié)合GC-MS方法進(jìn)行檢測。利用該方法測定了新疆幾種市售的常見食用植物油和幾種特種食用植物油中3-MCPD酯的含量，評估新疆市售食用植物油中3-MCPD酯的風(fēng)險水平的同時也為食用植物油中3-MCPD酯變化規(guī)律的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞麻籽油、紅花籽油、核桃油、花生油、番茄籽油、葡萄籽油、核桃油、菜籽油： (均為一級油，生產(chǎn)地均為新疆)；3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.6%)；氘代同位素d5-3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.5%)；3-MCPD 棕 櫚 酸 二 酯標(biāo)準(zhǔn)品 ( 98%)，d5-3-MCPD 棕櫚酸二酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度97%)；N-七氟丁酰基咪唑(98%)；甲基叔丁基醚、無水硫酸鈉、冰醋酸：分析純；甲醇鈉：化學(xué)純；乙酸乙酯、甲醇、正己烷：色譜純。

7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀；85-2 恒溫磁力攪拌器；EL204 電子天平；Xcelvap 全自動氮吹濃縮儀；Milli-Q 去離子水發(fā)生器；CleanertMCPD 氯丙醇專用固相萃取柱。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取 3-MCPD、d5-3-MCPD、3-MCPD 棕櫚酸二酯、d5-3-MCPD 棕櫚酸二酯各 10.0 mg (精確至 0.1 mg)，分別置于4支10 mL棕色容量瓶中，加入乙酸乙酯配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液，于-20 ℃冰箱內(nèi)冷藏儲存。分別將單標(biāo)儲備液用乙酸乙酯稀釋至 100 mg/L，作為標(biāo)準(zhǔn)中間液。使用時用正己烷逐級稀釋100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液至所需濃度。

1.3 樣品前處理

1.3.1 水解與凈化

水解：準(zhǔn)確稱取0.10 g油樣至12 mL具蓋玻璃試管中，加入50 μL 10 mg/L的d5-3-MCPD 棕櫚酸二酯內(nèi)標(biāo)溶液(相當(dāng)于 100 ng 游離態(tài)的 d5-3-MCPD)，加入0.5 mL甲基叔丁基醚-乙酸乙酯(8∶2)混合液后，45 ℃下超聲混勻。加入0.5 mL 甲醇鈉-甲醇(0.5 mol/L)室溫下水解4 min后，迅速加入3.0 mL冰乙酸溶液(1.0 mL冰乙酸溶于30 mL 20% NaCl溶液中)，充分渦旋混勻。加入3.0 mL正己烷脫上層油相，渦旋靜置。待明顯分層后，去除正己烷層，該步驟重復(fù)3次。

凈化：將下層水相溶液上樣于 CleanertMCPD 固相萃取柱中，待液體完全進(jìn)入硅藻土填料后，靜置平衡 10 min。再用 15 mL 乙酸乙酯-正己烷體系(體積比為11∶9)洗脫3-MCPD組分，將洗脫液接收于具蓋玻璃管中，于40 ℃水浴下氮吹濃縮至近干，用2 mL異辛烷溶解殘渣。

衍生化：向凈化后的溶液中加入 50 μL HFBI衍生試劑，旋緊蓋子并渦旋混勻，置于 70 ℃恒溫干燥箱中反應(yīng) 20 min。衍生化完成后，取出冷卻至室溫，加 3 mL 水并渦旋振蕩 30 s后靜置分層，棄去下層水相，重復(fù)水洗 3 次后取上層有機(jī)相，經(jīng)無水硫酸鈉除水后裝入進(jìn)樣瓶中，待GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS檢測

色譜條件：DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度280 ℃；柱始溫80 ℃ ，保持1 min，再以10 ℃/min升溫至190 ℃，以40 ℃/min升至300 ℃，保持5 min；載氣：高純氮，流速3.0mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積：1 μL。

質(zhì)譜條件：EI+，電子倍增器增益：+250 V，燈絲電流：100 μA；阱溫度：230 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；歧盒溫度：50 ℃；溶劑延遲：3 min；質(zhì)譜采集時間：3～20 min；掃描質(zhì)量范圍：m/z90～300; 掃描速率：0.65 s/次。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品制備條件的優(yōu)化

水解步驟主體參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.191—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的測定》，但在以下3個方面進(jìn)行調(diào)整：(1)使用冰乙酸與20%氯化鈉混合溶液(體積比1∶30)中和溶液中過量的甲醇-甲醇鈉溶液。一方面降低因先加冰乙酸再加氯化鈉溶液復(fù)雜操作引起的誤差；另一方面3-MCPD酯的甲醇/甲醇鈉溶液水解是一個快速的過程，加入乙酸與20%氯化鈉混合溶液可以快速終止反應(yīng)，避免堿過量造成的3-MCPD分解。(2)洗脫時，采用乙酸乙酯-正己烷體系(體積比為11∶9)作為洗脫液。實驗中發(fā)現(xiàn)在乙酸乙酯中添加一定比例的正己烷能使之更好地匹配3-MCPD的極性，以減少非目標(biāo)物質(zhì)的干擾。試驗結(jié)果表明乙酸乙酯-正己烷體積比為11∶9 時的回收率最高。(3)復(fù)溶時，國家標(biāo)準(zhǔn)中使用的溶液是正己烷，但正己烷在70 ℃高溫的衍生化步驟中極易揮發(fā)，導(dǎo)致定容體積不準(zhǔn)，因此改用揮發(fā)性較弱的異辛烷進(jìn)行復(fù)溶。

2.2 3-MCPD和d5-3-MCPD的HFBI衍生物的定性分析

采用間接法檢測分析3-MCPD酯，最終是通過將3-MCPD酯堿水解成3-MCPD后，再經(jīng)過HFBI衍生化進(jìn)行GC-MS檢測分析。在3-MCPD衍生物的質(zhì)譜圖中(圖1)，m/z169 [C3F7]-、197[C3F7CO]-、225[C3F7CO2C]-離子碎片的相對豐度較大，但其均為七氟丁酰基的特征離子，并不是3-MCPD衍生物的特征離子。本文采用代表性的3-MCPD衍生物的特征離子作為定性、定量離子，如

圖1 3-MCPD衍生物的質(zhì)譜圖

表1所示。其中，m/z=253是3-MCPD的HFBI衍生物[M-C3F7CO2-HCl]+碎片離子的質(zhì)荷比，m/z277(275)是[M-C3F7CO2CH2]+碎片離子的質(zhì)荷比，m/z289(291)是[M-C3F7CO2]+的碎片離子質(zhì)荷比，m/z453是[M-CH2Cl]+碎片離子的質(zhì)荷比。相應(yīng)的d5-3-MCPD的衍生物的對應(yīng)離子碎片質(zhì)荷比為m/z=257、278(280)、294(291)、456[12]。

表1 3-氯丙醇及其內(nèi)標(biāo)物衍生產(chǎn)物的特征離子

注：下劃線離子為定量離子，其余為定性離子。

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 線性范圍、檢出限、定量限

準(zhǔn)確移取一定量的3-MCPD以及d5-3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)溶液于具蓋試管中，用正己烷定容至2 mL，配制成相當(dāng)于樣品中3-MCPD含量為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。利用梯度濃度的3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如圖2所示。以3-MCPD以及d5-3-MCPD衍生物的定量離子峰面積之比為縱坐標(biāo)，3-MCPD質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。得到的線性方程為Y=0.289 9X+0.045 2，R2=0.988 5。以信噪比(S/N)為3和10時對應(yīng)的加標(biāo)水平分別作為方法的檢測限和定量限。此方法在0.5～2.5 mg/L范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好，檢出限為0.025 5 mg/kg，定量限為0.093 3 mg/kg。滿足油脂中3-MCPD酯的分析檢測。

圖2 3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 加標(biāo)回收率

取15份胡麻油樣品，其中3份空白對照，其余樣品中分別加入0.50、1.00、2.00、2.50 mg/kg 3-MCPD棕櫚酸二酯標(biāo)準(zhǔn)液，每組做3個平行樣，經(jīng)過樣品前處理后檢測3-MCPD酯含量，計算相應(yīng)的加標(biāo)回收率和RSD，如表2所示。結(jié)果表明3-MCPD

表2 加標(biāo)回收率實驗(n=3)

脂肪酸酯的平均加標(biāo)回收率在94.80%～104.62%之間，RSD 1.47%～5.23%。表明本研究所建立的方法的準(zhǔn)確度和精密度較高，適用于食用植物油中3-MCPD酯含量的測定。

2.3.3 儀器精密度

選取3個濃度分別為0.50、1.00、2.00 mg/kg的3-MCPD標(biāo)品衍生后進(jìn)行GC-MS檢測，平行進(jìn)樣3次，計算測定值的RSD。結(jié)果如表3所示，3個濃度的3-MCPD標(biāo)品的RSD值在1.83%～3.51%，表明儀器的性能良好，可以進(jìn)行相關(guān)的實驗。

表3 儀器精密度(n=3)

2.4 新疆幾種市售食用植物油中3-MCPD酯的含量

檢測新疆產(chǎn)的幾種市售食用植物油，每種油脂做3個平行樣。結(jié)果取平均值如表4所示。

表4 新疆幾種食用植物油中3-MCPD酯的測定結(jié)果

由表4可以看出，新疆市售的幾種食用植物油中均檢測出濃度不等的3-MCPD酯。在新的國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017《食品中污染物痕量》中對于液態(tài)調(diào)味品中3-MCPD的限量為0.4 mg/kg，固態(tài)調(diào)味品中3-MCPD的限量為1.0 mg/kg。借此標(biāo)準(zhǔn)，可以看到在新疆的幾種食用植物油中，菜籽油、亞麻籽油、番茄籽油、花生油以及葡萄籽油受3-MCPD酯的污染較嚴(yán)重，含量都高于0.4 mg/kg。其中葡萄籽油、菜籽油中3-MCPD酯的含量在1.0 mg/kg以上。而核桃油、大豆油、紅花籽油中3-MCPD酯的含量都低于0.4 mg/kg。

造成食用植物油中3-MCPD酯的含量的差別一方面原因與其自身的組成成分有關(guān)。不同的食用植物油中所含有的3-MCPD酯的前體物質(zhì)如三酰基甘油酯、氯離子、脂肪酸等存在著差異性[13]。另一方面與油脂的精煉工藝的差異有關(guān)。食用植物油的精煉過程的四個主要步驟：脫膠、脫酸、脫色和脫臭。在精煉的時候，若采用磷酸進(jìn)行脫膠，可能會增加食用植物油中氯離子的含量，導(dǎo)致3-MCPD酯含量的增加；脫色白土的種類和酸性強(qiáng)弱也會影響食用植物油中3-MCPD的生成。目前已初步證實，精煉過程中的脫臭工序是3-MCPD酯生成的主要環(huán)節(jié)[14]。脫臭工序是在高溫加熱條件下去除不需要的低沸點組分。在這過程中，植物油中的氯離子與?；视王サ?3-MCPD酯的前體物質(zhì)通過SN1取代反應(yīng)生成 3-MCPD 酯。因此，在脫臭工序前盡可能除去3-MCPD酯的前體物質(zhì)可以有效的預(yù)防3-MCPD酯的生成[15-16]?；蛘咄ㄟ^適當(dāng)?shù)恼{(diào)整脫臭工序，比如采取分步脫臭。第一步進(jìn)行低溫長時間水蒸氣蒸餾去除大部分不需要的易揮發(fā)組分，第二步高溫短時間水蒸氣蒸餾去除剩余少量高沸點組分。縮短高溫加熱時間，也可以有效的降低油脂中3-MCPD酯的形成。

3 結(jié)論

3.1 本實驗通過甲醇鈉-甲醇堿水解，固相萃取柱凈化，HFBI衍生結(jié)合GC-MS方法測定食用植物油中3-MCPD酯含量。該方法在0.50～2.50 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為0.025 5 mg/kg，定量限為0.093 3 mg/kg。3-MCPD酯的平均加標(biāo)回收率在94.80%～104.62%之間，RSD 1.47%～5.23%。本方法靈敏度高重復(fù)性好，能夠很好的適用于食用植物油中3-MCPD酯的檢測。

3.2 采用了該方法測定的新疆幾種市售食用植物油中的中3-MCPD酯的含量。在新疆市售的幾種食用植物油中均檢測出濃度不等的3-MCPD酯。其中菜籽油、亞麻籽油、番茄籽油、花生油以及葡萄籽油受3-MCPD酯的污染較嚴(yán)重，3-MCPD酯的含量都高于0.4 mg/kg。而核桃油、大豆油、紅花籽油中3-MCPD酯的含量都低于0.4 mg/kg，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。